①引物的序列应位于基因组DNA的高度保守区,且与非扩增区无同源序列。这样可以减少引物与基因组的非特异性结合,提高反应的特异性
②引物长度:15-40bp为宜。引物过短或过长均可使反应的特异性下降。
③引物的碱基尽可能随机发布,避免出现数个嘌呤或嘧啶的连续排列,G+C碱基的含量在40%-75%之间。
④引物内部应避免形成二级结构,特别是引物的末端应避免有回文结构。
⑤二个引物不应有互补序列,特别是3’端应避免互补,以免形成“引物二聚体”,浪费引物。
⑥引物5’末端碱基无严格限制,在与模板DNA结合的引物长度足够的条件下,其5’端碱基可不与模板DNA互补而呈游离状态,因此可在引物5’端加上限制性内切酶位点、启动子序列或其它序列等以便于PCR产物的分析克隆等,引物的5’端至多可加10个碱基而对PCR反应无影响。
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