一般根据支原体种类不同，采取不同的方法进行检测。目前常用的检测方法有：
1. 试剂盒检测法：
目前已有专门做支原体检测的试剂盒，可以用细胞滴片进行检测。
2. 观察细胞的形态和生长特征：
支原体污染比较严重时可出现生长减慢，有的培养基pH明显变酸，并出现细胞病变，以此可依次对支原体污染进行检测，但有些情况下支原体污染引起的病变特征与病毒感染相似，因此不能准确诊断。
3. 分离培养法：
大多数支原体可出现特有的典型菌落。因而可依次尽心检测，该方法准确、可靠，但时间长，敏感性不够高。
4. DNA结合荧光素染色法：
利用荧光染剂（bisbenzimide,Hoechst 33258）侦测支原体污染。荧光染料会结合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich区域，因为支原体DNA中A-T含量占多数（55～80%），所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之荧光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体之污染。
5. 电子显微镜和免疫电子显微镜法：电子显微镜或者免疫电镜下对样本进行观察，此法较准确，但受条件限制，时间长，敏感性不高。
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6. 间接免疫荧光法和免疫印迹：简便、快速、特异性强。
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