选择色谱柱之后，下一个最重要的决定就是准确选择将进入流动相的物质。如上所述，SEC分离的基本原则之一是应选择条件，以使保留（化学意义上）最小。如果实现了此方法，则可确保洗脱体积是分子大小的指标。乍一看，这似乎应该很简单-我们应该选择一种固定相，该固定相不会通过与分析物的特定类型的相互作用而强烈地相互作用，然后选择一种流动相，其中分析物具有很高的溶解度并且能够最小化分析物与固定相的相互作用。但是，如果我们从50年的液相色谱学中学到了什么，最大的经验教训之一就是，固定相或分析物的化学性质或结构上的细微变化都可能导致保留率发生较大变化。确实，在开发新方法时，我们经常在反相分离中充分利用这些相互作用。但是，实施此方法还意味着在蛋白质的SEC分离中实现“无保留”条件可能非常困难。有大量的文献描述了研究，这些研究探索了使用不同的流动相改性剂和条件以最小化固定相与分析物之间的相互作用。
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