超氧化物歧化酶的测定

　　超氧化物歧化酶（SOD）的催化底物是O2 ，一般多以一定时间内产物生成量或底物的消耗量作为酶活性单位。由于O2 自身很不稳定，且不易制备，测定SOD的方法除少数采用直接法外，一般多为间接法。

　　1.直接法 原理是根据O2 或产生O2 的物质本身的性质测定O2 的歧化量，从而确定SOD的活性。经典的直接法包括：脉冲辐射分解法、电子顺磁共振波法（EPR）、核磁共振法。由于所需的仪器设备价格昂贵，一般较少应用。

　　2.一般化学法 这些方法的共同特点是要有一个O2 的产生体系和一个被O2 还原或氧化的可检测体系。在SOD存在下，一部分O2 被SOD歧化，因而O2 还原或氧化检测体系的反应受到抑制。根据反应受抑制程度，测定SOD的活性。一般化学法有邻苯三酚自氧化法、细胞色素C还原法、羟胺法、黄嘌呤氧化酶-NBT法、肾上腺素法、没食子酸法、6-羟多巴胺法、亚硝酸盐形成法和碱性二甲亚砜法。

　　常用的有：

　　⑴邻苯三酚自氧化法：即改良Marklund法。原理是基于经典的分光光度法，在碱性条件下，邻苯三酚自氧化成红桔酚，用紫外-可见光谱跟踪波长为325nm、420nm或650nm（经典为420nm），同时产生O2 ，SOD催化O2 发生歧化反应从而抑制邻苯三酚的自氧化，样品对邻苯三酚自氧化速率的抑制率，可反映样品中的SOD含量。本法具有特异性强，所需样本量少（仅50μl），操作快速简单，重复性好，灵敏度高，试剂简单等优点。

　　⑵细胞色素C还原法（McCord法）：原理是黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系中产生的O2 使一定量的氧化型细胞色素C还原为还原型细胞色素C，后者在550nm有最大光吸收。在SOD存在时，由于一部分O2 被SOD催化而歧化，O2 还原细胞色素C的反应速度则相应减少，即其反应受到抑制。将抑制反应的百分数与SOD浓度作图可得到抑制曲线，由此计算样品中SOD活性。本法是间接法中的经典方法，但本法灵敏度较低。

　　3.化学发光法原理是黄嘌呤氧化酶在有氧条件下，催化底物黄嘌呤或次黄嘌呤发生氧化反应生成尿酸，同时产生O2。后者可与化学发光剂鲁米诺反应，使其产生激发。SOD能清除O2 从而抑制鲁米诺的化学发光。本法可应用于SOD的微量测定，不仅灵敏度高，简便易行，而且特异性与准确性至少与细胞色素C还原法类似。

　　4.免疫学方法上述方法测定的是SOD活性，免疫学方法则可测定样品中SOD的质量，因此特异性较好，是较理想的测定SOD方法，免疫法有放射免疫法、化学发光免疫分析法、ELISA法等。但其缺陷是只能测定抗体相应的抗原，对于检测不同种类的SOD，则须制备相应的特异性抗体，手续繁琐。

　　5.电泳法电泳染色定位法的基本原理是根据光化学法与NBT还原法。电泳则采取垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳。既可采用SOD活性正染色（呈现棕色区带）也可采取SOD活性负染色（呈现无色透明区带）。根据凝胶上电泳分离的SOD区带的着色深浅与面积大小，对样品进行半定量分析，也可制作校正曲线计算样品中的SOD含量。染色定位法常用于鉴定SOD，很少为了定量，主要原因是它不及化学法简便，但鉴定SOD却较化学法为优。用电泳法可鉴定SOD是否掺有杂质蛋白，有无同工酶，且可半定量地确定SOD的活性大小。

　　6.平行放在距20 W荧光灯管3 cm处的光照台上，光照8 min后，立即在200A分光光度计的460 nm波长下比色。用测得的结果计算样品中的SOD含量.....