细胞培养基灭菌的方式分为高压灭菌和膜过滤除菌，不同的培养基由于其营养成份不同，灭菌方式也可能不同。
某些培养基（如MEM）可进行高压灭菌，这类培养基一般不含有L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，一般是在培养基高压灭菌后才加入。另外可用耐高压的谷氨酸盐（如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）代替L-谷氨酰胺。可高压灭菌的培养基在121℃、15 psi，15分钟的条件下完全可达到灭菌效果及营养成分的最小损失，不需将灭菌时间延长。
绝大多数细胞培养基不适宜高压灭菌。因培养液中常含有维生素、蛋白质、多肽、生长因子等物质，这些物质在高温或射线照射下易发生变性或失去功能，因而上述液体多采用过滤消毒以除去细菌。可供过滤灭菌使用的滤膜很多，其材料多为polyethersulphone（PES）、尼龙、多聚碳酸盐、醋酸纤维素、硝酸纤维素、PTFE、陶瓷等。膜过滤除菌是当前较为常用及便捷的一种方法，常采用0.2 μm孔径的滤膜，部份采用0.1 μm孔径。与高压过滤方式相比，滤膜具有使用期限且价格较高，但对细胞培养基的营养成份破坏性较小。
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