神经组织由神经元、胶质细胞构成，并有血脑屏障、外周免疫细胞的广泛参与，如何有效这些结构的生长发育、病理过程，对于机制研究、药物靶向开发具有重要价值。神经组织的核心即为神经元，如何保证神经元的存活及发挥正常生理功能，始终是本领域的重要节点。目前，体内、体外研究均已实现分子水平的观察，GFP等荧光方法的发明，实现了近些年基础研究的极大拓展和丰富。并且，单细胞光遗传等技术，在体对神经细胞功能进行精准调控，对神经元功能观察更为灵活、准确。小编在此结合神经组织细胞功能表型、常用研究方法，为各位神经领域研究者提供实验方法思路。而分子克隆、基因编辑等技术，将在近期整理出，为诸君提供参考。
（一）常规拍照或录像
1. 细胞迁徙
划痕实验
创伤愈合实验是一种简单、廉价的方法，也是最早发展起来的研究定向细胞在体外迁移的方法之一。该方法模拟了细胞在体内愈合过程中的迁移过程。基本步骤包括在细胞单层中创建一个“伤口”，在细胞迁移过程中在开始和定期捕获图像以关闭伤口，以及比较图像以确定细胞迁移速率。划痕法测量适用的细胞范围较小，一般只适用于上皮细胞，纤维样细胞。虽然无血清培养可以忽略细胞增殖的影响，但是由于细胞内信号传导系统整体性的下调节，细胞迁移的速度也会慢很多。
划痕实验
（图片来源于网络）
Transwell实验
transwell 实验为研究肿瘤细胞的迁移侵袭转移情况的一种简便快捷的实验方法，还可以构建两种细胞的共培养体系以及趋化性试验。原理简单地说就是用一层膜将高营养的培养液和低营养的培养液隔开，细胞放在低营养的培养液里，为了找吃的，细胞会往高营养的培养液里面跑，但是有膜挡着，所以要穿过膜即迁徙成功。首先在膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，细胞分泌金属蛋白酶将基质消化，从低营养的培养液跑到高营养的培养液里，最后检测高营养的培养液里细胞量可以知道细胞的侵袭能力。而迁移实验就是不铺胶直接让细胞穿过就行了。
Transwell实验
（图片来源于网络）
2.血管生成
血管形成实验是测量在体外血管生成的一种快速的、可量化的方法。一般做的比较多的是研究内皮细胞的血管形成。在体外,内皮细胞接种在一定基底上,易形成网状结构,可通过拍照观察计数对血管结果进行定量分析。肿瘤血管生成是一个极其复杂的过程,包括血管内皮基质降解、内皮细胞移行、内皮细胞增殖、内皮细胞管道化分支形成血管环和形成新的基底膜等步骤。研究表明无论是原发性肿瘤还是继发性肿瘤,其直径一旦超过2 mm,都会有血管的生成,这是由于肿瘤细胞自身可分泌出多种生长因子,这些生长因子可以诱导血管的生成,抑制这一过程将能明显阻止肿瘤组织的发展和扩散转移,因此体外血管形成实验广泛应用于抗肿瘤药物的研究中。
血管生成镜检图
（图片来源于网络）
3.神经发生
神经发生实验将新鲜组织切片置于基质胶进行培养，以研究神经组织细胞轴突等结构的发芽、形成，相关内容类似于上文血管生成部分。
3D胶原基质上的脊柱器官型培养（SOCs）
（来源：David Romeo-Guitart ,.2019,cells,8,1354.）
（二）荧光成像
1.细胞增殖
BrdU（5-bromo-2-deoxyuridine，5-溴-2-脱氧尿苷）作为体内细胞增殖的标记物的应用，类似于3H-TdR，可在S期掺入到细胞DNA中，因此同3H-TdR一样可用来检测经历增殖的细胞。BrdU抗体的对应抗原是含有BrdU的单链DNA，所以反应时必须使DNA单链完全暴露（可用NaOH、HCl或热处理达到变性的目的）。BrdU的优点在于它无放射性，对机体和单个细胞的毒性小；操作时不需要特殊的实验设备（如3H-TdR放射自显影需要暗室）；实验程序所经历的周期短，用免疫组织化学的方法在两三天内即可出结果，而3H-TdR放射自显影可能需要4-12周的时间；3H-TdR的放射性只能穿过1 mm厚的组织切片，因此只有位于切片表面2-3 mm的3H-TdR可以检测出来，BrdU在30 mm厚的切片上可清楚地辨别出。
小鼠大脑SGZ、SVZ区BrdU荧光观察
（来源：Kunlin Jin,.Brain Res, 2006, 1085(1).）
2.细胞吞噬
小胶质细胞作为大脑中的“清洁工”，可通过吞噬Aβ等蛋白、组织碎片，维持神经组织内环境的稳态，故属于细胞功能的重要方面。小胶质细胞的吞噬功能，利用凋亡的神经祖细胞作为目标，因为在体外环境下它能最模拟自然条件下小胶质细胞的吞噬目标。另外一种方法是采用荧光微珠的方法，小胶质细胞将其吞噬后，在共聚焦显微镜下观察细胞内微珠的数量，即提示细胞吞噬能力。当然，荧光微珠也可以用流式细胞仪进行检测。
细胞吞噬实验
（来源：Cai et al. Journal of Neuroinflammation (2017) 14:63 ）
3.示踪技术
神经示踪常用于观察神经元突触连接、脑区联系、神经再生等研究，工具包括病毒载体、荧光染料等。以荧光染料为例，周围神经损伤术后神经远端注射荧光金（FG）染料，轴突再生的神经元可逆向运输FG，从而呈现阳性。
脊髓荧光金染色
（来源：Falgairolle M, . PLoS One, 2015,10(6).）
4.荧光探针
在紫外-可见-近红外区有特征荧光，并且其荧光性质（激发和发射波长、强度、寿命、偏振等）可随所处环境的性质，如极性、折射率、粘度等改变而灵敏地改变的一类荧光性分子。受到激发光激发后，从激发态单重态回到基态，在紫外-可见-近红外区有特征发光，称之为荧光。荧光性质（激发和发射波长、强度、寿命、偏振等）可随所处环境的性质，如极性、折射率、粘度等改变而灵敏地改变的一类荧光性分子，被称为荧光探针。荧光探针分类很多，可以根据材料属性分为有机和无机探针，可以根据探针尺寸分为分子探针和纳米探针，也可以根据激发光源分为单光子、双光子及多光子荧光探针，还可以根据待测物分类为金属离子荧光单子和生物分子荧光探针等等。荧光探针在各种检测和标记中应用广泛，比如测定金属离子、农药残留、生物分子含量、示踪生物分子，标记大分子及细胞和亚细胞结构等方面。今年诺奖的离子通道研究即需要荧光探针的使用。
香港大学化学发光H2O2探针用于实时活体成像
（来源：Sen Ye,.Angew. Chem. Int. Ed.,2020.）
（三）细胞分选
流式细胞分选
流式细胞分选，它可根据发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分开并可实现单克隆分选，能复杂样本中的细胞进行鉴定、分类、定量和分离，单次可同时对其中一种到四种特定细胞进行超高速分选纯化、高通量单克隆分选或细胞芯片制备。分选后的细胞能直接用于培养、移植、核酸提取、单细胞PCR扩增或原位杂交等，可进一步进行细胞基因、蛋白、功能水平的研究和不同细胞之间的差异化研究。硬件中样本细胞丢弃的比例低于5%，保证样本中目标细胞的高回收率。其中免疫细胞分选较为常用，比如分选获得记忆性T细胞、Treg细胞。
流式细胞分选
（来源：bio-protocol.org）
（四）电生理
1.神经电生理
神经电生理(electrophysiology method) 是用电生理仪器、微电极、电压钳(voltage clamp)及膜片钳(patch clamp)技术等记录或测定整体动物或离体器官组织、神经和细胞离子通道等的膜电位改变、传导速度和离子通道的活动的方法。神经肌电生理学方法(electrophysiology method) 是用电生理仪器、微电极、电压钳(voltage clamp)及膜片钳(patch clamp)技术等记录或测定整体动物或离体器官组织、神经和细胞离子通道等的膜电位改变、传导速度和离子通道的活动的方法。常用于在屏蔽干扰的环境中精确地测定包括各种器官的自发性电活动（如心电、脑电、神经电）、诱发电位(evoked potential)和离子通道开放和关闭的等电活动。
神经电生理示意图
（图片来源于网络）
2.神经环路研究
神经环路是脑内不同性质和功能的神经元通过各种形式的复杂连接。脑内不同性质和功能的神经元通过各种形式的复杂连接，在不同水平构成神经环路（neural circuit)和神经网络(neural network)，以类似串联、并联、前馈、反馈、正反馈、负反馈等多种形式活动。其中最简单的神经环路是三突触机构。即上一级神经元的轴突分枝一方面兴奋一个主神经元，另一方面通过兴奋中间神经元抑制该主神经元，从而在一个最小的环路上达到兴奋与抑制的平衡。更复杂的神经环路可见于神经网络的不同层次水平。在环路中兴奋性与抑制性活动相互作用，其最终效应取决于许多神经元活动正负相消后的净得值，也就是神经活动的整合作用。
光遗传通常是指结合光学与遗传学手段，精确控制特定神经元活动的技术。斯坦福大学Diesseroth实验室2007 年发表在《自然》(Nature)上关于光控制神经回路的文章[1]，被麻省理工学院技术综述评为该年度十大最有影响的技术之一。2010年该技术入选Nature Methods 年年度方法（Method of the Year）”，Science杂志“十年突破（Breakthroughs of the Decade）”该技术利用分子生物学、病毒生物学等手段，将外源光敏感蛋白基因导入活细胞中，在细胞膜结构上表达了光敏感通道蛋白；然后通过特定波长光的照射，控制细胞膜结构上的光敏感通道蛋白的激活与关闭；光敏感蛋白的激活和关闭可控制细胞膜上离子通道的打开与关闭，进而改变细胞膜电压的变化，如膜的去极化与超极化。神经元生物学家经常运用这种技术，通过光学方法无损伤或低损伤地控制特异神经元的活动，来研究该神经网络功能，特别适用于在体、甚至清醒动物行为学实验。
老鼠大脑神经环路
（图片来源于网络）
（五）影像学
小编在此以阿尔茨海默病为例介绍影像学的价值，其中CT、MRI可观察到AD患者脑实质萎缩、脑室扩大，不用于表型研究，故不在此赘述。
1.磁共振成像（MRI）
磁共振成像（MRI）和正电子发射断层扫描（PET）可用于测量淀粉样蛋白和tau沉积、脑代谢和脑体积。当然，合适的MRI造影剂标记目标细胞群，顺磁造影剂是临床应用最广泛的MRI造影剂之一。超顺磁性氧化铁粒子改良自顺磁性粒子，灵敏度更高，逐渐占据主导地位，被应用于胶质瘤细胞，单核细胞和T细胞示踪。
人体大脑MRI比较
（来源：Chandra A,J Neurol, 2019.）
2.正电子发射断层扫描（PET）
PET/CT可应用相应示踪剂，可观察AD患者Aβ、tau、糖代谢变化。Amyloid PET可以在第一个症状出现前15-20年内检测到淀粉样斑块的病理性沉积。
PET/CT检测tau蛋白
（来源：Schmidt ME, .Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2020.）
（六）小节
荧光方法作为目前最普遍的技术，其应用实践远远不止本文的陈述。综上可知，神经领域研究的复杂性对仪器设备供应商提出了巨大挑战，组学研究的兴起明显提升了数据挖掘速度及论文可读性。表型作为目的，方法作为桥梁，将两者有效结合，相信对神经领域的基础、临床研究具有重要意义。
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