常用的测定方法有取样法和连续法。
取样法是在酶反应开始后不同的时间，从反应系统中取出一定量的反应液，并用适当方法停止其反应，再根据产物和底物在化学性质上的差别进行分析，求得单位时间内酶促反应的变化量。
连续法则是基于底物和产物在物理化学性质上的不同，在反应过程中对反应系统添加酶的变性剂以终止反应。常用的连续测定法是光吸收测定法，即根据产物和底物在某一波长或波段上有明显的特征吸收差别而建立起来的连续观测方法。几乎所有的氧化还原酶都可用此法测定，此外如荧光法、旋光法、电化学法也是常用的连续测定方法。
对不易直接测定的反应，可使用酶偶联分析法，即用过量、专一的“偶联工具酶”，使被测反应继续进行到某一可直接测定的阶段。
近年来，酶活性的测定工作正向两个方向发展，一是超微量酶活的灵敏测定，二是实现测定过程的自动化控制。
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