从培养组织中分离单细胞指将愈伤组织反复继代培养，再转移至液体培养基振荡培养。这是获得单细胞使用最广泛的一种方法。将表面消毒后的植物器官新鲜切片放置在培养基(固体)上，培养基含适当比例的生长素和细胞分裂素，以保证组织培养的顺利进行。外植体切口处形成愈伤组织，逐渐生长扩展到外植体组织的整个表面。将愈伤组织从外植体上分离，转移到成分相同的新鲜培养基上，促使愈伤组织生长。在琼脂培养基上反复继代培养，使愈伤组织结构疏松，为建立优质细胞悬浮系打下基础。液体培养基分装在经高压灭菌后的三角瓶或其他培养瓶中，转入未分化和疏松的愈伤组织块。然后，将三角瓶或培养瓶置于台式摇床或适宜设备上，持续振荡培养。振荡培养的培养基对愈伤组织块产生适度的压力，将愈伤组织分离成游离单细胞和小细胞团。此外，加强培养基和培养瓶内空气之问的气体交换，并使培养基中细胞和细胞团分布均匀。
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