分析测试百科网

搜索

喜欢作者

微信支付微信支付
×

如何测定葡萄糖氧化酶的活性

2022.6.22
头像

超级艾蛋木啊

致力于为分析测试行业奉献终身

测酶活性的实验:
.用萃取化学公司法(Amano法的改进型)测定葡萄糖氧化酶
(1)试剂


磷酸盐缓冲液(pH7.0):取6.805g磷酸二氢钾(KH2PO4; Merck, Art.4873)溶于350mL蒸馏水中。用1M氢氧化钠溶液(NaOH (4g溶于100ml水))将pH值调至7.0,用蒸馏水定容至500mL。


邻-联二茴香胺(o-Dianisidine)溶液:取1.7mg邻-联二茴香胺(C14H16N2O2; Serva, Nr,19175)溶于25ml磷酸盐缓冲液。


过氧化物酶(辣根过氧化酶,181U/mg)溶液(约0℃):取1.7mg过氧化物酶(Serva, Nr,31943)溶于5ml蒸馏水。每毫升此溶液中应含有60个红紫倍精单位。


底物溶液(约0.55M):取5.0gβ-D-葡萄糖(C6H12O6; Sigma, No.G-5250)溶于蒸馏水中,定容至50mL。
使用前,至少得将此酶静置3h。


酶(待测的葡萄糖氧化酶)溶液:用磷酸盐缓冲液溶解该酶。1mL配制的酶溶液中应含有大约0.1U。
0.0037g溶于500μl PBS, 再取10μl前者溶液定容至100PBS(约0.1U/ml)。
测酶活性(118U/mg)的实验2
(1)操作步骤:将0.50mLβ-D-葡萄糖溶液、0.10mL在冰水中冷却过的过氧化物酶(辣根过氧化酶)溶液和2.4mL邻-联二茴香胺溶液滴入一只小烧杯内混合,调温至25℃,然后将其全部加到1cm的比色皿内,最后加0.1ml酶于待测的葡萄糖氧化酶溶液,同时按动秒表。在连续15min内每隔1min于436nm处测一次吸光度
(2)计算:用以下公式计算活性:

式中:E436――每分钟吸光度的变化(436nm处)(15次的平均值)
Ew――0.1ml所用酶液中含酶的重量(0.000074mg)
8.3――1μmol邻-联二茴香胺/mL的吸光度(436nm处)
3.1――反应混合物的总体积
U1=53.25U/ mg; U2=93.21U/ mg; U3=13.30U/ mg
测酶活性(118U/mg)的实验5(061218)
(1)操作步骤:将333μlβ-D-葡萄糖溶液、67μl在冰水中冷却过的过氧化物酶(辣根过氧化酶)溶液和1.6mL邻-联二茴香胺溶液滴入一只1cm的比色皿内,调温至25℃,最后加67μl酶于待测的葡萄糖氧化酶溶液,搅拌均匀(搅拌同时计时,共用8s,),然后重新按动秒表。在连续15min内每隔1min于436nm处测一次吸光度
(2)计算:用以下公式计算活性:

式中:E436――每分钟吸光度的变化(436nm处)(15次的平均值)
Ew――67μl所用酶液中含酶的重量(0.00004958mg)
8.3――1μmol邻-联二茴香胺/mL的吸光度(436nm处)
2.067――反应混合物的总体积
GOD:
15min的平均值:
U1=181.23U/mg; U2=167.36U/ mg; U3=156.11U/ mg
4min的平均值:
U1=156.56U/ mg; U2=129.89U/ mg, U3=134.97U/ mg

互联网
仪器推荐
文章推荐