去磷酸化的对象和方法的介绍

　　一、组织和抗体来源

　　该研究中的AD及年龄、性别匹配对照者的脑组织来源于死后6小时内的尸体解剖(各取6例混合后制备匀浆)，AD确诊基于尸检组织切片的病理学检查，人脑组织均贮于-75℃直至使用。牛脑PP-2A和PP-2B的分离纯化分别参照Cohen等[5]和Sharma等[6]的方法。多克隆抗体92e和102C由Iqbal小组制备。单克隆抗体tau-1和PHF-1分别由Binder和Greenberg提供。单克隆抗体SMI-31，SMI-33和SMI-34从Sternberg单克隆公司购买。碱性磷酸酶标记的抗鼠和抗兔IgG从Sigma公司购买。

　　二、tau蛋白样品的制备

　　PHFII-tau蛋白制备参照Iqbal等[7]的长程序从AD患者脑中制备。其简要步骤如下:将AD大脑皮质去脑膜及白质后制备匀浆，再用不同孔径尼龙膜进行筛分，在2%SDS溶液中加热和超声破碎，不连续蔗糖密度梯度离心和玻璃珠层析。ADP-tau的制备参阅Kopke等[1]法。

　　三、去磷酸化反应

　　除特别标明外，去磷酸化反应均在37℃进行45分钟。反应混合液中含50mmol/LTris-HCl(pH7.0)，20mmol/Lβ-巯基乙醇，0.1g/L牛血清白蛋白，1.0mmol/LMnCl2；各0.01g/L抑肽酶(aprotinin)，Leupeptin和胃酶抑素(pepstatin)，0.07g/LPHF-Ⅱ-tau，2U/mlPP-2A或5U/mlPP-2B(1单位PP-2A或PP-2B分别指在30℃，每分钟催化磷酸化酶a或磷酸化酶激酶释放1.0nmol磷酸的酶量)。在用PP-2B进行的去磷酸化反应液中，还含有1mmol/LCaCl2和1μmol/L钙调素。ADP-tau的去磷酸化反应条件除用较低的磷酸酶浓度外[8，9]，其余同PHFII-tau的去磷酸化条件。去磷酸化位点的检测用免疫印迹法。

　　四、免疫印迹法

　　经去磷酸化处理的样品先用4倍体积预冷丙酮进行沉淀，再溶于SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)样品缓冲液，煮沸5分钟后进行5%～15%SDS-PAGE。所用一级抗体的稀释倍数及特性见附表。印迹样品用碱性磷酸酶标记的抗鼠或抗兔IgG作为第二抗体，以5-溴-4-氯-3吲哚磷酸-对氨基甲苯盐(BCIP)和对硝基蓝四唑氯(NBT)作为底物进行显色分析。