RNA聚合酶链式反应(PCR)步骤

1），准备工作

    8， 实验器具与材料: (1)移液枪:200ul、10ul (2)吸头:200ul、20ul

    (3)吸头台:放置 200ul 和 20ul 的吸头一个 (4)EP 管 1.5ml、100ul

2），实验器具的处理与准备

    (1) 塑料制品:(包括吸头、EP 管等)

    送至高压 3 次，试验前将枪头放入吸头台。 

3）, 试剂配制和准备:

    (1) 双蒸水: 100ml 盐水瓶内装 40ml 蒸馏水，送至高压，后分装到几个 1.5mlEP 管中， -20°C中保存备用。

    (2) PCR 中所需要的各种试剂 三，PCR 时注意事项:

    佩戴一次性手套，同时避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。

       4），PCR 步骤

    1， 准备 100ul EP 管

    2， 依次在管中加入:(50ul 反应体系)

    ddH2O

    10mM dNTP

    10×PCR buffer

    25mM Mgcl2 (加之前要摇匀) 上游引物

    下游引物

    模板cDNA 1ul

    3， 稍离心

    4， 100°C沸水浴 1 分钟

    5， 趁热加入 Tag 酶 0.5ul(冰上操作) 6， 再加入 50ul 液体石蜡封闭

    7， 10000rmp 离心 1 分钟

    8， PCR 条件

    94°C 1min

    58°C 50sec

    72°C 1min30sec

    进行 40 个循环，然后 72°C 10min 完后 4°C保温。

    9，10000rmp 离心 5min

    10，将下层水相转入新的 0.65mlEP 管中，-20°C保存。