6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-PGDH）活性测定试说明书

6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-PGDH）活性测定试说明书  微量法 100T/96S 

注 意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： 磷酸戊糖途径途径中 6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）和 6PGDH 依次催化 NADPH 合成，与能量的平衡、 生长速率和细胞活力等密切相关。此外，6PGDH 逆境生理中具有重要作用。 

测定原理： 6PGDH 催化 6-磷酸葡萄糖酸和 NADP+生成 NADPH，NADPH 在 340 nm 有特征吸收峰，而 NADP+没 有；通过测定 340nm 吸光度增加速率，计算 6PGDH 活性。 自备仪器和用品： 低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、酶标仪、96 孔板和蒸馏水。

试剂组成和配制： 提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。 试剂一：液体 19mL×1 瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。 试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存。 

粗酶液提取： 1、细菌、细胞或组织样品的制备： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提 取液体积（mL）为 1000~5000：1 的比例（建议 2000 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或 细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰 上待测。 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提 取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 2、血清（浆）样品：直接检测。 测定操作： 1. 酶标仪预热 30min，调节波长到 340 nm。 2 将试剂二和试剂三转移至试剂一中充分溶解；在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min 以上； 用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 3. 取 96 孔板，依次加入 10μL 样本 190μL 试剂一，于 340nm 处测定 3min 内吸光值变化，第 10 s 吸光值 记为 A1，第 190s 吸光值记为 A2。△A=A2-A1 注意：空白管只需要做一次。 计算公式： 使用 96 孔板测定的计算公式如下 1、血清（浆）6PGDH 活力的计算: 单位的定义：每 mL 血清（浆）每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 6PGDH（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷V 样÷T=2143.6×ΔA 2、组织、细菌或细胞中 6PGDH 活力的计算: QQ 1019057849 （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 6PGDH（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(V 样×Cpr) ÷T=2143.6×ΔA÷Cpr （2）按样本鲜重计算： 单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 6PGDH（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=2143.6×ΔA÷W （3）按细菌或细胞密度计算： 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 6PGDH（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(2000×V 样÷V 样总) ÷T=1.072×ΔA V 反总：反应体系总体积，1×10-3 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光径， 12.5px；V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，3 min；Cpr： 样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞总数，2000 万。