确定诊断需靠细菌培养阳性(自血液、脑脊液、尿液、局部病灶中)而皮肤和黏膜的阳性只表示带菌。
细菌的抗原诊断进展很快，不论用过抗生素与否，均可用抗原检测方法，常用的有乳胶凝集、协同凝集、对流免疫电泳和酶联免疫吸附试验等以对流免疫电泳的准确性较好，对GBS含量少的标本则优于抗原检测细菌培养。
特异性GBS抗体升高可以提示近期GBS感染，抗链球菌溶血素O(ASO)和抗去氧核糖核酸酶B(DNAseB)只对GAS的诊断有助，不适用于GBS。
GBS的检出率依赖于多项因素，多数学者建议从宫颈、阴道及肛周联合取材以提高阳性率。多数学者认为，越接近产时筛查GBS阳性率越高，故美国妇产科协会(ACOG)、美国儿科协会(AAP)建议对孕35～37周的所有孕妇进行检测。检测方法主要有细菌培养和抗原测定。
1.细菌学检查：GBS对培养基要求较高，肉汤选择性培养基可显著提高阳性率，是明确GBS的基本手段。首选SMB或Lim肉汤选择性培养基。由菌落形态、溶血特性、显微镜下所见及生化反应可以确定链球菌，采用族和型特异性血清进行免疫学试验可最后确定GBS。中国已有自制抗血清用于鉴定GBS。Field采用阴道分泌物涂片进行革兰染色快速诊断GBS，诊断符合率较高，有一定实用价值。
2.细菌抗原检测：近年用于GBS检测的有乳胶微粒凝集试验（LA）、协同凝集试验（COA）、对流免疫电泳试验(CIE)及酶联免疫试验(ELISA)等，前两种国外均有商品试剂盒出售。GBS全身感染时抗原检测阳性率可达50％～80％，甚至100％。
3.特异性抗体检测：免疫荧光抗体检测培养6小时的标本，敏感度和特异度分别为49％和99％，阳性预测值和阴性预测值分别为89％和92％，标本直接检查敏感度较低。
4.分子生物学检查：有人用脉冲场凝蚀电泳法（PFGE），限制性酶切片段长度多态性分析（RFLP），核酸探针法及核酸内切酶法等检测GBS，均取得较好的效果，但均未能应用于临床。
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