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①目的蛋白质未充分转移到膜上或洗膜过度，应使用丽春红S染色以检查转膜效果，或减少洗膜次数，缩短洗膜时间；
②抗体不匹配或一抗过期或一抗不能识别变性或还原的蛋白质，应注意选择特异性的抗体并在有效期内使用，或改用非变性凝胶系统；
③抗体浓度低，应适当增加抗体浓度，或延长孵育时间；
④样品中的目的蛋白质含量低或没有目的蛋白质，应增加上样量；
⑤封闭过度，应更换封闭液，缩短封闭时间。
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