1、核酸分子的浓度和场地：核酸分子浓度越高，复性速度就越快，探针长度最好选在50-300个碱基；
2、温度：温度偏高不利于复性，温度偏低则不利于少数碱基配对形成的局部双链的解离，适合的温度是较Tm值低25度；
3、离子强度：离子强度越高，杂交反应越快，而且高浓度的盐有利于稳定错配碱基杂交体的稳定性增加，所以在进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交液和洗膜液中盐浓度；
4、杂交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交反应的Tm值，其优点在于：在低温下探针的稳定性增加，且更好地保留非共价结合的核酸；
5、核酸分子的复杂性：是指存在于反应体系中不同顺序的总长度；
6、非特异性杂交反应：在开始核酸分子杂交之前须对非特异性杂交位点进行封闭，以减少其对探针的非特异性吸附作用。
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