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孵育过夜一般多见于封闭液。二抗孵育过夜比较少见。因为二抗中酶的活性可能容易受到影响，并且如果在二抗孵育阶段有微生物滋生，后续洗涤步骤少，容易干扰显色。二抗浓度太高、孵育时间太长了 。洗膜不够,可以尝试3次,每次15min 。如果片子全黑,要考虑胶片是不是已经曝光了。
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