认知自然界的本质一定要了解相互作用，先辈们已总结了4种基本相互作用：引力相互作用、电磁相互作用、强相互作用和弱相互作用。就生命科学涉及的分子研究尺度而言，主要研究的是后两种相互作用。人们已经发展了ELISA、免疫共沉淀等一些经典的分子互作方法，但其只能描述终点。新型的分子互作仪器可以研究实时、动态的相互作用，不仅可以在研究层面更好揭示分子相互作用的机理，支持高分文章频现；而且有力支撑生物制药产业的发展，因其在新药筛选中大幅提升效率，降低新药开发成本。近年来，分子互作市场迅猛增长，据乐观估计2028年其全球市场将接近20亿美元。市场一路高歌，江湖派别林立，接下来本文将首先捋一下分子互作的主流派系和市场概况。
分子互作示意图：蛋白和DNA互作
生物分子的活性和功能是通过分子间的相互作用来实现的。人们习惯称分子相互作用的一方为受体（主体），另一方为配体（客体），受体与配体之间的作用，会引起生物、化学、物理等性质的变化；分子互作技术就是利用物理、化学或光学等检测手段，对这种肉眼无法捕捉的变化，从动力学、亲和力及热稳定性角度进行表征和测量，表征方式包括结合常数、结合的配比、结合位点、作用方式、自由能变等，其中结合常数是表征相互作用强弱最重要的参数之一。从广义上说，主客体的相互作用主要研究小分子之间、大分子之间、小分子与大分子及分子组装体之间的结合。其相互作用方式包括共价作用和非共价作用，其中非共价键力的弱相互作用力包括范德华力、亲水一疏水相互作用、静电力和氢键等。
从传统方法来看，在蛋白质相互作用的研究方面，常用传统方法如：酵母双杂交、免疫共沉淀（Co-IP）、酶联免疫（ELISA），荧光共振能量转移（FRET），免疫印记（Western, Far-Western）、质谱等等。在涉及核酸相互作用的研究方面，常用传统方法如：EMSA，ChIP （染色体免疫沉淀法，Co-IP的类似技术）。传统方法的难点在于不够准确、费时费力、大都只有终点测定。
SPR表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)仪器的发明，开启了蛋白质相互作用研究的新方向。它特异准确、能定性和定量、最难能可贵的是，它可以描述分子间相互作用的动态过程（结合动力学），而不只是终点测定，这点尤其难能可贵。比如某种药结合蛋白较快，但很快就解离，需要多次给药；而另一种药结合蛋白较慢，解离也很慢，一次给药延续时间很长。对结合过程的描述可以指示药效和给药方式的不同。
不同的结合与解离速率反映了不同的作用机制，也决定了分子不同的功能与结构特征
沿着SPR准确且可测定动力学过程的思路，科学家又发明了多种新技术，如生物膜干涉（Bio-Layer Interferometry, BLI）、光栅耦合干涉技术（Grating-Coupled Interferometry，GCI）和等温滴定微量热（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）等非标记的技术。当KD值作为描述结合动力学的主要参数后，标记技术也登上分子互作分析的舞台，比如微量热泳动（MicroScale Thermophoresis, MST）和光谱位移技术（Spectral Shift）。
分子互作仪主要测定参数包括：
描述亲和力（Affinity），用解离平衡常数（KD），KD描述配体和分析物分子之间的结合强度，生物学意义是，当1:1结合时，让50%A分子饱和时B分子的浓度。浓度单位M，数值越小结合越强。对于SPR来说，KD=kd/ka，其中kd是分析物与配体之间的解离速率，ka描述分析物与配体之间结合的速率。
表征仪器主要性能的指标还有：测定的灵敏度、目标分子活性含量(Concentration)、单次实验的时间，以及多通道、高通量测定的能力等。
经典SPR
1902年，Wood在光学实验过程中发现了表面等离子共振（SPR）现象：当电磁波射向金属表面时，其反射光谱会产生异常，表现为在特定角度下反射光强度明显下降，光谱上出现明显的暗带，而且金属膜表面折射率的变大会导致暗带位置发生变化。1968年科学家解释了该现象：SPR现象来源于消逝波和金属表面等离子波的共振。1990年，Biacore AB公司（现隶属丹纳赫旗下Cytiva）开发了首台商品化SPR仪器Biacore。
SPR技术原理：当光从光密介质射向光疏介质，入射光满足一定条件时会发生全反射现象。从波动光学的角度来研究全反射，入射光到达界面时并不是直接产生反射光，而是先透过光疏介质约一个波长的深度，再沿界面流动约半个波长再返回光密介质，而光的总能量没有发生改变，透过光疏介质的波被称为消逝波。由于金属中含有自由电子，可以看作一种等离子体，入射光激起电子的纵向振动，振动产生的电荷密度波，沿着金属和电介质的界面传播，形成表面等离子波。金属表面等离子波与消逝波发生共振时，检测到的反射光强度会大幅度地减弱（能量几乎接近零）。当入射光波长固定时，反射光强度是入射角的函数，其中反射光强度最低时所对应的入射角为共振角，即SPR角。
Biacore的传感器由表面涂有一层薄金膜的玻璃片构成，大多数应用中金膜上覆盖的是葡聚糖基质，葡聚糖不仅可以作为固定分子的基底，还能为相互作用提供亲水环境，亦可使用其它基质固定特定类型的分子，Biacore提供十余种不同芯片。一个互作分子（配体）偶联在传感器芯片的表面，另一个（分析物）通过连续流系统输送到芯片表面。
SPR本质是一种折射率传感器。SPR使从传感器表面的玻璃侧以特定角度反射的光强度降低，当分子结合到传感器表面时，传感器表面的折射率发生变化，改变了最小反射强度的角度，SPR角度的变化与结合物质的质量成正比。当样品溶液流过芯片时，对反射指数变化的检测结果构成传感图，其中Y轴上的结合响应值与X轴上的时间相对应。由于光线不会穿透到样品侧，因此可以对有颜色的、混浊的或不透明的样品进行分析。通过分析所生成的传感图，可以测定是否结合、特异性、亲和力、动力学和活性浓度。传感图提供了整个相互作用过程的实时信息。更多原理视频
SPR工作原理
SPR的优点是经典，分子量最低检测限从100Da到无限制，灵敏度高，应用范围广；缺点是仪器光路、微流控流路相对复杂。SPR技术在国际上得到了充分的认可，最新版的美国药典（USP39）、日本药典（JP17）、2020年版《中华人民共和国药典》都将SPR技术作为分子互作分析“金标准”技术。
LSPR局域等离子共振
在经典SPR之上，人们发展了LSPR局域等离子共振技术。当入射光子频率与贵金属纳米颗粒传导电子的整体振动频率相匹配时，纳米颗粒会对光子能量产生很强的吸收作用，发生局域表面等离子体共振现象（LSPR），当溶液中的分子与固定的探针结合引起生物分子层厚度的变化，从使LSPR吸收峰发生位移，LSPR检测方法可对这种即时变化（吸收峰的位移及波长变化）做动态检测。
LSPR局域等离子共振技术示意图
纳米胶体金传感器(1.5mm2)比传统金膜小，相较SPR技术，LSPR具有成本低、灵敏度高等优势。首先，传统SPR使用持续金膜，而LSPR采用纳米金颗粒感应器，在可见光范围内可产生很强的共振吸收峰，使得颗粒周围的局域折射率高度敏感，从而对位置具有高灵敏度，能检测出吸收位置范围内非常小的波长改变，这与传统SPR的角度检测有很大区别。其次，LSPR的衰减波长比SPR小，更小的感应体积意味着LSPR对分子偶联更灵敏，而体积改变对检测的影响也会相应更小，甚至系统受外部变化如温度漂移，缓冲液折射率改变等人工因素的干扰程度也会大大降低，从而进一步保证了实验结果的高精确度。
3D纳米SPR——MetaSPR
在原有SPR技术基础上，中国的量准公司开发了MetaSPR技术。纳米杯阵列表面等离子体共振（Nanocup Array-enhanced SRP）原理是：当入射光照射到表面光学金属纳米结构时，可引起金属自由电子的共振，由于电子共振致使光的二次发射，从而形成特定的反射光谱。芯片表面的分子或溶液的变化会导致特定波长处等离子共振的反射光强度发生改变。当反射光谱发生位移后的波长减去位移之前的波长时，在某一波长光的强度显著降低，某一波长强度显著上升。因此可以通过获取生物反应过程中两波长的反射光强变化，得到分子互作信号（感觉比LSPR更向前了一步），这与传统基于SPR入射光角度变化的技术是不同的。
MetaSPR技术原理示意图
MetaSPR将光学芯片由原来的二维基膜变成了三维基膜。与传统SPR的平面膜芯片相比，MetaSPR芯片的纳米孔阵列的电磁衰减长度( ld )要短得多，可大幅度降低样本的Bulk效应，适合复杂样本以及未经纯化的粗样本。此外，三维基膜的芯片将信号放大了千倍以上，带来更高的检测灵敏度和更低的分子浓度检测下限。同时，也不再需要传统复杂的光路系统来捕捉微弱的信号，变成了简单的LED光源和光电二极管，这极大简化工艺路径，从而降低成本。
SPR+成像
在SPR技术基础上，近年来又衍生了SPRi表面等离子共振成像技术，成像为用户带来了两个颇有意义的功能：实现了整个工作区域的可视化以及高通量平行实验。SPRi可进行多重分析，不同类型的配体可以固定在单个 SPRi-Biochip 生物芯片上。可以同时研究多个参数（浓度、固定 pH 值等），方便对分子进行比较、排序和选择。此外，也有将SPR和光学显微镜结合的技术，可体外测量单个细胞在其天然环境中的结合反应和动力学。
基于Kretschmann构型的SPRi示意
在SPRi中，准直光束通过棱镜照向整个功能化的金表面，覆盖所有点样点。在芯片上反射后，光束被探测器的成像传感器（二维阵列）获取，每个像素对应于 SPRi-Biochip 生物芯片上的给定位置。动力学测量包括同时监测多达几百个样点的反射率随时间的变化。传统的 SPR 系统可并行监控少量的相互作用。成像系统由于采用了一种特殊的流通池，能够并行监测多达数百个相互作用。此外，与其他技术（如质谱）的耦合在通道系统中非常复杂，而SPRi-MS的连接非常直接、效率更高。
MP-SPR多参数表面等离子共振
MP-SPR与传统SPR最大的区别在于光学方面，传统的SPR的光学测量仅仅集中于非常窄的θ角范围内，而MP-SPR能够扫描很宽的θ角范围(几十度)。通过扫描一系列角度，提供完整的SPR曲线和多个参数，并提取多个感应图谱；而且，一次完整扫描可包括两种环境：气体和液体。
2001年作出原型机后，华人科学家谭洪在美国硅谷创办了Fortebio公司，2005年推出首款基于生物膜干涉技术（Biolayer Interferometry）的分子互作产品Octet QK，2011年Fortebio被美国Pall公司收购，2015年Pall被丹纳赫收购，由于反垄断的要求，2020年后该产品隶属赛多利斯。2020年底，BLI技术被正式收录于《美国2021版药典》1108章。
BLI通过检测干涉光谱的位移变化来测定分子互作。其工作原理是：一束可见光在传感器末端的光学膜层的上下界面会形成两束反射光谱，并形成一束干涉光谱。分子结合后膜厚增加，干涉光谱右移，记录波长的位移值（Δλ）为Y轴，横轴是时间，可以实时检测结合的情况，分析物的浓度和斜率正相关。当然，解离时波长位移值会下降。BLI的优点是：对任何未结合的分子，周围介质折光率的变化或流速的变化均不会影响干涉图谱，因此可直接对粗样品进行分子互作分析；缺点是：无法有效检测到小分子的相互作用。更多原理视频
BLI检测原理示意图
许多领域都是10年一种新技术，分子互作也不例外。既然主要的测定参数是平衡解离常数Kd值，再设计一种原理来获取Kd值也可以。2010年，NanoTemper推出了第一款基于微量热泳动技术的分子互作仪Monolith NT.115。
微量热泳动技术（MST）源于一种物理现象：溶液中的分子会在温度梯度场中定向移动。1856年，Carl Ludwig和Charles Soret最初发现该现象。Stefan Duhr 和Philipp Baaske在慕尼黑大学攻读博士期间阐明了热泳动的理论基础，获得两项ZL并于2008年创办了NanoTemper公司。
MST基于荧光信号来检测分子互作。MTS的基本原理是：互作的一个Target分子带上荧光基团，另一个作为配体Ligand。样品装在毛细管中，上方包含荧光的激发检测单元LED以及精准加热样品的红外激光器。实验开始采集MST曲线，一开始有初始荧光，打开红外激光加热20秒，可检测到衰减的荧光曲线。荧光信号衰减首先来源于荧光分子发生了热泳动（Thermophoresis），即加热后分子朝着远离热源的方向发生泳动，泳动的范围取决于分子的整体性质，包括大小、电荷及水化层；其次荧光强度有温度依赖性（TRIC），通常随温度升高衰减。当荧光分子结合配体后，会间接地通过改变构象来影响荧光分子的化学微环境，从而导致荧光信号衰减的速率发生改变，衰减曲线会发生上移或下移。
MST检测原理示意图
这种改变依赖于配体的浓度，在MST实验中，可将配体比例稀释成16个浓度，在曲线上选取一个时间点如5秒，以配体浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标作图，将得到16个点，拟合出一条S形结合曲线，从而得到解离常数Kd值，Kd代表当一半的Target被结合时，所需要的Ligand浓度，Kd值越小，亲和力越强。
MST技术不需要固定样品，样品在溶液中检测，只需要将Target分子标记上荧光基团，不受 buffer限制，几乎覆盖全部类型的分子，具有灵敏度高，简便、快速、样品消耗少等特点。更多原理视频
2022年，NanoTemper又推出基于光谱位移技术的Dianthus和结合两种技术的Monolith X。光谱位移技术也基于荧光信号变化。荧光标记的样品有特定的发射光谱，配体结合后导致微弱的发射光谱位移（蓝移或红移亚nm范围）。实验时仍将配体进行比例稀释，加入恒定浓度的荧光分子，在用590nm的光激发样品后，仪器会同时监测双波长（650nm和670nm）下配体结合引起的光谱位移，将两种波长下的荧光强度比值与对数的配体浓度作图，可拟合得到平衡解离常数Kd。光谱位移技术检测速度非常快，只需1分钟即可完成Kd检测。更多原理视频。
光谱位移技术检测原理示意图
2015年，瑞士Creoptix公司（现隶属马尔文）推出基于光栅耦合干涉技术（Grating-Coupled Interferometry，GCI）的实时分子互作仪器WAVE。一束激光光源通过光栅将光耦合在波导传输结构中，对应一束参比光从相位调制器（Phase Modulator）进入另一个光栅和其耦合，因此会形成相位差和干涉花纹。当结合分子后，会改变芯片表面的折光率变化，而导致检测光的相位发生变化。
相比传统SPR，GCI利用了波导技术，消逝场对样品的穿透深度更小，仅在芯片表面与样品溶液接触，并延长了其与样品相互作用的长度，如从100nm延申光路长度到2mm，因此灵敏度更高（< 0.015 pg/mm2），分析物的分子量无下限。此外，WAVE的流路中，所有阀路远离芯片并无需气阀，因此不易堵塞，对粗样品更友好。在动力学测定中，除了传统方法，还可以用waveRAPID方法，无需稀释多个梯度，只从单孔进样，采用持续时间增加的重复脉冲进样（RAPID），也可拟合出动力学曲线，比传统动力学检测约快10倍，可改进基于片段的小分子筛选和动力学分析，加速药物开发的过程。
此外，Creoptix GCI 读数方案的优势在于干涉图是在时域和波导管内生成，而不是投射到 CCD 摄像机上。因此，与经典的波导干涉仪或SPR相比，将传感器表面的折射率变化作为与时间相关的相移信号进行测量可提供更可靠的读数，而不受温度漂移或振动的影响，从而在信号和时间上实现出色的分辨率。更多原理视频。
光栅耦合干涉技术GCI
ITC也是一种量化研究生物分子相互作用的无标记技术，可直接测量生物分子结合过程中释放或吸收的热量。实验时，保持仪器样品池和参比池温度相同，通过加热补偿原理检测体系热量变化，从而得到生物分子的结合信息。
ITC检测方式与化学反应中的酸碱滴定法相似，可以测定结合配偶体在自然状态下的亲和力。实验过程中，配体（如受体、抗体）分子在恒温条件下滴定到相互作用分子的溶液中，结合释放的热（H）被实时记录下来。连续进行多次滴定，分子结合释放或吸收的热直接正比于结合的分子数量，当系统达到饱和时，只能观察到稀释热。将每次滴定产生的热效应与滴定和被滴定分子的摩尔比作图，可以得到一条结合曲线。ITC能自动完成滴定、数据采集和分析，使整个实验过程非常简单。主要代表产品为2015年马尔文推出的手动 MicroCal PEAQ-ITC系统与新型全自动MicroCal PEAQ-ITC 系统。
ITC检测原理示意图
ITC技术具有快速、准确、样品用量小、对反应体系的要求不高（如对体系的透光度、浑浊度、粘滞度要求不高）等优势，被广泛应用于生物及医药等相关领域。商业化等温滴定量热仪最早出现在上世纪80年代后期，在过去的近30年中，ITC技术成为研究分子相互作用的常用方法之一。随着科学技术的发展，等温滴定量热仪将会更加灵敏、快速、易用。
分子互作分析仪是生命科学研究、新药研发的核心工具，是生物制药、CRO、CDMO、科研机构的标配设备。
据Insight Partners，全球分子互作检测市场规模预计将从2021年的4.7482亿美元增长到2028年的8.2971亿美元，年复合年增长率（CAGR）为8.3%。分子互作耗材在2021年占据了很大的市场份额，预计在2021-2028年期间将达到8.6%的最高复合年增长率。根据MMR，2021年分子互作检测市场的价值为6.2445亿美元，预计到2029年将达到11.356亿美元，预测期间（2022-2029年）的CAGR为7.76%。而Data Bridge市场研究机构预测更为乐观，到2028年分子互作检测市场将达到19.6亿美元。但无论哪种预测，共同点都看好未来分子互作仪器市场。
据蛋壳研究院估算，2020 年中国分子相互作用仪市场容量约 27.6 亿元，2022年的市场规模将达8亿元。
创新是企业致胜的法宝，近年来，各分子互作仪生产企业在研发上投入大量资金，不断将新的检测技术和产品引入市场。对生物技术和新药发现的高投资是推动亚太地区分子互作产品市场增长的主要因素。各国政府机构起草并颁布实施与制药行业有关的国家法律、法规、政策和标准。
思拓凡（Cytiva）、赛多利斯（Sartorius），诺坦普（NanoTemper）、马尔文帕纳科（Malvern PANalytical）、伯乐（Bio-rad）、布鲁克（Bruker）、堀场（HORIBA）、怀雅特（被Waters收购）、量准（Xlement）等是在分子互作市场运营的主要公司。厂商都在积极采取多种战略增加竞争力，比如推出不断新产品实现产品多样化、扩大市场占有率，以及获得新的客户群来挖掘更多的商业机会。
2021年，技术进步、政府大量资金投入、药物研究项目的加速发展，推动亚太地区在分子互作全球市场中占有最大份额。中国的制药行业已经从关注仿制药转向创新疗法。2021年，中国的在药物研发上投入首次超过了美国，而且，中国在研发支出中所占的份额进一步增加。据预测，北美地区分子互作在2021-2028年有最高的年复合增长率，该增长源于社会对分子水平研究的支持、药物研究项目的极大增加及现有检测方法具有更高灵敏度等因素。例如，美国化学学会（ACS）和毒理学学会（SoT）均是支持非标记技术研究的组织。
分子互作检测产品的市场分为仪器和耗材。未来，消耗品细分市场可能会占据最大的市场份额，并以最高的复合年增长率增长。
从技术角度，分子互作检测市场分为表面等离子体共振SPR，生物层干涉测量BLI，光栅耦合干涉技术GCI、等温滴定量热ITC、微量热泳动技术MST等。按照MMR 2021年总结，SPR占据最大的市场份额，达到20%，并在预测期内具有最高的复合年增长率，SPR一个重要的应用市场是高通量药物筛选（HTS）。
分析测试百科网整理了近两年多（2021年1月~2023年4月）分子互作分析仪中标信息，涉及金额超2.8亿多元。此外，本次中标统计主要汇总了高校、科研院所和医院等政府采购平台发布的信息，本网特对中标信息进行分析形成相关统计图（见图9），以飨读者。根据统计分析，美国Cytiva和德国Sartorius两家品牌仍占据大部分市场份额，占比分别为33.11%和27.15%。排名第三的德国NanoTemper这几年发展迅猛，凭借可靠的技术和产品获得了19.86%的市场占有率。国产品牌Gator和北京英柏生物也分别占有一席之地，打破了之前国产品牌空白的窘境。此外，Malvern、Reichert、Nicoya、Biosensing Instrument等品牌也有一定市场份额。不过，该图表尚不能反映研发型药企和CRO企业的采购情况。
分子互作仪主要品牌国内市场占有情况
按照市场应用，分子互作检测市场分为结合动力学，结合热力学，内源性受体检测，活性物确定，生成先导物和其它应用。目前，结合动力学应用占据最大的市场份额，并在2022~2028年间有最高的复合年增长率。导致该细分市场增长的因素是，制药业对分子互作的需求不断增长，结构生物学的进步，使用分子互作检测新冠病毒的研究性工作不断增长。
基于最终用户，分子互作检测市场分为制药公司和生物技术公司、医院、高校和研究机构。到2022年，制药和生物技术公司占据最大的市场份额，并在2022~2028年间有最高的复合年增长率。过去的2022年，由2000亿贴息贷款专项引爆了国内的仪器的采购市场，其中分子互作仪在10-12月中标数量达到了全年高位水平，高于前九个月之和。
亚洲经济体（以中国和印度为主）的增长，以及对生物技术和药物研发资金投入的增加，是推动亚洲非标记检测市场的主要因素。亚洲国家拥有生物技术产业众多的科学人才，地区的产业合并、合作和伙伴关系数量亦在增加。例如，2018年7月，Ferring制药（瑞士）在印度Hyderabad建立基因组谷（Genome Valley）研发实验室和制造工厂。
欲知分子互作江湖上的各门派代表团队和其新产品，且听下回分解......
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