1、实验室检查找到真菌和菌丝可以确诊，涂片检查是早期快速诊断真菌感染的有效方法，随病变进展，不同部位重复刮片可提高阳性率。
2、常用方法有角膜刮片Gram和Giemsa染色，氢氧化钾能溶解非真菌杂质而显示真菌菌丝，若10%～20%氢氧化钾湿片刮片及培养均为阴性，而临床又高度怀疑者，可考虑作角膜组织活检，角膜刮片或组织培养阳性是诊断真菌感染的最可靠依据，同时可鉴定真菌菌种。
3、此外，免疫荧光染色、电子显微镜检查和PCR技术也用于真菌角膜炎的诊断。角膜共焦显微镜作为非侵入性检查，可直接发现病灶内的真菌病原体。
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