硫酸软骨素钠的含量测定方法

含量测定

照高效液相色谱法(通则0512)测定供试品溶液取本品约0.1g,精密称定,置10ml量瓶中,加水溶解并定量稀释至刻度,摇匀,用0.45{m滤膜过滤,精密量取100,置具塞试管中,加三羟甲基氨基甲烷缓冲液取三羟甲基氨基甲烷6.06g与醋酸钠8.17g,加水900ml使溶解,用稀盐酸调节pH值至8.0,用水稀释至1000m)80Oμl,充分混匀,再加入硫酸软骨素ABC酶液(取硫酸软骨素ABC酶适量,按标示单位用上述缓冲液稀释制成每100中含0.1单位的溶液)100ul,摇匀,置37℃水浴中反应1小时,取出,在100℃加热5分钟,用冷水冷却。以每分钟10000转离心20分钟,取上清液,用0.45m滤膜滤过。对照品溶液取硫酸软骨素钠对照品适量,精密称定,加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含10mg的溶液,用0.45gm滤膜过滤,自“精密量取1001”起制备方法同供试品溶液。色谱条件用强阴离子交换硅胶为填充剂( HypersilSAX柱,46mm×250mm,5m或效能相当的色谱柱);以水用稀盐酸调节pH值至3.5)为流动相A,以2mol/L氯化钠溶液(用稀盐酸调节pH值至3.5)为流动相B;按下表进行线性梯度洗脱;检测波长为232nm;进样体积20l时间(分钟)流动相A(%)流动相B(%)0系统适用性要求对照品溶液色谱图中,出峰顺序为软骨素二糖峰、6-硫酸化软骨素二糖峰和4-硫酸化软骨素二糖峰,软骨素二糖峰、6-硫酸化软骨素二糖峰与4-硫酸化软骨素糖峰之间的分离度均应符合要求。测定法精密量取供试品溶液与对照品溶液,分别注入液相色谱仪,记录色谱图。按外标法以软骨素二糖、6-硫酸化软骨素二糖和4硫酸化软骨素二糖的峰面积之和计算。