基本信息
论文题目： Translational Regulation of Plant Response to High Temperature by a Dual Function tRNAHis Guanylyltransferase in Rice
发表期刊：Molecular Plant
发表时间：2019.5
影响因子：9.326
作者单位：中科院上海植物生理生态研究所林鸿宣院士研究组
本文涉及的高通量技术：酵母文库（欧易生物提供建库服务）
研究背景
高等植物在整个生命过程中是固着生长的,它们在面对环境中的各种胁迫因素时无法像动物一样自由地移动以躲避不利因素。因此,植物在长期的进化过程中发展出多种应对环境胁迫，尤其是环境温度的策略。遗传学和基因组学等证据表明，蛋白质在不同水平调控植物响应环境高温胁迫。但是，对于蛋白翻译调控植物高温适应性的研究仍较少。
研究内容
作者克隆到一个水稻tRNAHis鸟苷转移酶基因AET1， 该基因突变体在上海高温条件下表现为矮秆、叶片卷曲、结实率低，但在海南冬季低温时表型与野生型“特靑”类似。有趣的是，AET1在内质网上与核糖体相关蛋白RACK1A和eIF3h互作，并且AET1能够直接结合生长素响应因子OsARF 的转录本。多聚核糖体分析表明，在aet1突变体中，蛋白翻译状态没有明显变化，但是OsARF19 和OsARF23 的蛋白翻译效率在高温条件下显著降低。本文研究表明，AET1具有tRNA修饰和蛋白翻译调控的双重功能，在植物响应环境高温胁迫过程中发挥重要作用。
研究结果
1. 作者通过EMS诱变，筛选到一株温敏突变体aet1(Adaptation to Environmental Temperature 1)，其在上海和海南表现出显著差异的株高，叶片表型和结实率。图位克隆技术确定了该突变体相关基因AET1，其编码一个tRNAHis鸟苷转移酶。与野生型相比，突变体中AET1发生了Pro382Ser的氨基酸突变，导致aet1的茎面积和维管束数量显著降低。以上结果表明，AET1对高温条件下水稻的生长发育具有重要的功能。
图1 | 野生型及aet1表型分析
2. tRNA-EMSA实验表明，AET1-HIS对tRNAHis的5’端行使3’到5’RNA聚合酶活性，而AET1P382S-HIS丧失了这一催化活性，表明Pro382对tRNAHis的鸟苷转移酶活性具有重要功能。作者进一步通过tRNA测序发现，高温条件下aet1 突变体中具有更多的tRNA异形体（isotype），说明aet1 需要更多的tRNAHis以补偿AET1 的功能缺失。
图2 | AET1具有tRNAHis鸟苷转移酶活性
3.为了揭示AET1调控植物响应高温胁迫的分子机制，作者采用酵母双杂交文库筛选到AET1的互作蛋白:核糖体相关蛋白RACK1A和eIF3h，并且三者可以两两发生互作。进一步通过体外pull-down和体内BiFC实验证实了三者之间的互作。亚细胞定位实验表明，AET1，RACK1A和eIF3h都定位于内质网上，并且与核糖体蛋白S2共定位。另外，时空表达分析表明，这三个基因在各个组织中广泛表达，这一结果与其调控蛋白合成的功能一致。
图3 | AET1与RACK1A和eIF3h互作
4. 作者通过RIP-seq检测AET1结合的mRNAs。结果表明，野生型材料“特靑”中AET1能结合545个mRNAs，而在高温处理的aet1材料中只能结合208个mRNAs，其中50个mRNAs在两个材料中都能检测到。KEGG富集分析表明，“特靑”中AET1结合的mRNAs与光合作用和代谢过程相关，而在aet1中与氨基酸代谢通路相关。以上结果说明，AET1通过tRNA的不均衡分布调控蛋白质的合成。值得一提的是，生长素相关基因在“特靑”和aet1中具有显著差异，暗示AET1通过调控生长素信号通路参与植物抗高温胁迫。RNA-EMSA实验表明，AET1-HIS and AET1P382S-HIS都能够结合OsARF19 和OsARF23 的mRNAs，而RACK1A和eIF3h没有结合能力。以上结果说明，AET1能够结合OsARF 的mRNA，进而调控其翻译过程。
图4 | AET1直接结合OsARF 的mRNA
5. RACK1A 和 eIF3h是核糖体的重要组分，但是二者与AET1在蛋白质翻译过程中发挥的角色仍然未知。作者通过多聚核糖体分析发现，“特靑”和aet1在高温条件下具有相似的多聚体状态。进一步检测不同多核糖体片段中OsARF19 和OsARF23 的mRNA水平，证明了在aet1中mRNA水平低于“特靑”。为了阐明RACK1A和eIF3h 的功能，作者利用CRISPR/Cas9技术获得敲除突变体，表现为植株矮小，分蘖数减少，育性降低。
无论在转录还是翻译水平，AET1, eIF3h 和 RACK1A都受到高温诱导，而OsARF23 在高温条件下的表达量低于常温条件。另外，OsARF23 在RACK1A 和 eIF3h 敲除突变体中表达量都显著降低，表明AET1与eIF3h 和 RACK1A互作，协同调控OsARFs的翻译效率。
图5 | AET1与eIF3h，RACK1A互作调控OsARFs 的翻译效率
6. 那么AET1的缺失是否影响生长素信号通路呢？作者用不同浓度的外源IAA处理“特靑”和aet1， 发现突变体对IAA的敏感度显著降低。然而，当使用生长素抑制剂L-kynurenine处理植株，突变体表现出高度敏感性。以上结果表明，AET1能够响应生长素信号。pDR5：：GUS 转基因植株同样证实了这一结果。作者进一步检测了植株中内源生长素含量，发现无论高温还是常温条件下，aet1中生长素含量都显著降低，但是IAA水平有明显升高。另外，生长素响应基因在高温处理的突变体中同样下调表达。
图6 | AET1 响应生长素信号
研究结论
本文利用酵母双杂交技术，发现AET1除了具有鸟苷转移酶活性外，还能够与核糖体相关蛋白互作并调控蛋白翻译过程，为植物适应环境温度机制的研究提供新的思路。
参考文献
Chen K., Guo T., Li X.-M., Zhang Y.-M., Yang Y.-B., Ye W.-W., Dong N.-Q., Shi C.-L., Kan Y., Xiang Y.-H., Zhang H., Li Y.-C., Gao J.-P., Huang X., Zhao Q., Han B., Shan J.-X., and Lin H.-X. (2019). Translational Regulation of Plant Response to High Temperature by a Dual Function tRNAHis Guanylyltransferase in Rice. Mol. Plant. doi: https://doi.org/10.1016/j.molp.2019.04.012.
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