也许看到TXTL时，你会一头雾水，这是什么意思呢？TXTL是由两个单词缩写而来，基因的转录Transcription（TX）和翻译Translation（TL）。TXTL又称为无细胞转录-翻译系统，是合成生物学中用于生产重组蛋白的多功能平台，在从蛋白质工程到用于高通量筛选应用的合成生物学的许多科学领域中都广受欢迎。一般而言，TXTL主要过程是将核苷酸模板添加到包含 TXTL机制和基本结构单元的体外试剂混合物中，通过该混合物将DNA转录成RNA，并将RNA翻译成其编码的蛋白质。下图展示了Arbor Biosciences的myTXTL® 体外蛋白表达系统工作流程。该系统基于大肠杆菌细胞质提取物，以质粒或线性DNA为模板，依靠内源性核心RNA聚合酶和转录因子sigma 70（μ70），以及有效的能量再生系统，在几分钟内，可以从基因得到可以直接应用于功能分析的蛋白产物。
图1：使用myTXTL进行体外蛋白质生产的典型工作流程
与传统的体内基因表达相比，TXTL具有多种优势。首先由于可以完全忽略细胞活力，将不再产生有毒蛋白质。此外，由于体外系统的开放反应设置，辅助因子（酶工程）、去污剂和膜形成支持试剂（膜蛋白生产）等外源物质的添加变得特别容易。最后，完成设计-构建-测试周期的时间大大缩短，将基于细胞的测定数天的反应，缩短为仅仅数小时，成本降低并显着增加样本量。
本文中，我们将展示myTXTL与Echo 525纳升移液器结合，为需要在低成本检测中进行快速高通量处理、灵活性和重现性的基因表达项目提供全面的解决方案。本实验使用Echo 525的25nl精 准移液精度，以减少三倍的体积优化myTXTL系统内的不同基因表达系统。
作为由内源性大肠杆菌TXTL机制控制的基因表达的一个例子，编码增强型绿色荧光蛋白的工程版本的质粒P70a-deGFP被滴定到myTXTL的Master Mix中，用纯化的deGFP制备的标准曲线对TXTL中产生的deGFP进行量化。
TABLE1：以P70a-deGFP为模板建立4μL的myTXTL反应的纳升传输方案。将试剂从Echo 384孔聚丙烯2.0 Plus微孔板转移到不透明的Greiner 384孔检测板中。所有反应四次重复，在BMG Labtech PHERAstar FS酶标仪上读取荧光数据制作标准曲线如下图，平均CV为4.05%。
图2：4μL体积的deGFP标准曲线
在myTXTL中，来自T7启动子系统的基因表达需要外源添加T7 RNA聚合酶。为了将deGFP生产与T7 RNA聚合酶生产分离，我们决定在T7 RNA聚合酶控制的质粒 (T7p14-deGFP) 中，另外添加聚合酶酶，总体系为4μL myTXTL不变。使用deGFP标准曲线将生成的deGFP的特异性荧光信号转换为deGFP浓度。结果可知deGFP的产生非常迅速，仅在孵育2.3小时后就达到了平台期。在1单位T7 RNA聚合酶和2000pM T7p14-deGFP质粒处观察到了0.78nM的明显峰值deGFP。在蛋白质生产中观察到的快速下降可能是由于T7 RNA聚合酶活性随时间下降或T7 RNA聚合酶储存缓冲液中包含的甘油等成分的不利影响所致。下图中显示的结果表明，在使用无细胞系统时需要进行分析优化。使用Echo 525纳升移液器，能够准确、精确地传输具有大动态体积范围的多种流体类型，从而实现了这种优化。
图3：4μL myTXTL中，添加外源性T7 RNA聚合酶和T7p14-deGFP质粒，得到产物dGFP荧光值
本文中，我们展示了Echo 525纳升液体移液系统，对Arbor Biosciences的myTXTL无细胞表达系统的准确和精确处理。myTXTL Master Mix的高通量液体处理允许对数百到数千个基因模板构建体进行分析，并在几个小时内并行研究许多实验条件。同时，使用Echo 525构建高 效的体外基因表达系统可减少总反应体积，从而减少试剂成本，同时仍能产生足够的蛋白质用于下游分析和功能测定。与手工操作相比，使用Echo 525上运行的优化实验，不仅结果可靠，还将试剂消耗降低了3倍，并节省了许多天的准备时间。
首页
