使用 Overlap 系数最重要的缺点是:通道之间组分像素数比例会强烈影响Overlap 系数值。为了减少这种依赖性, Overlap 系数分成两个不同的子系数,看 k(1)和 k(2),以两个独立的参量来表达共定位的程度。
Overlap 系数 k(1)和 k(2)描述了通道之间强度的差异, k(1)对通道 2(绿色信号) 强度差敏感,而 k(2)线性依赖于通道 1 像素的强度值。因此,现在描述的方程能够说明重叠度,也能解释颜色通道之间的强度差异。在图像的共定位区域,为了估计其中一个颜色通道对整个共定位荧光的贡献,定义了另外一套共定位系数 m(1)和 m(2)。