直到 20 世纪 80 年代中期,尚无技术可用于基因组 DNA 黏性大片段的分离、扩增和分析。在此之前,如果要对某一 DNA 片段进行详细的物理和功能研究,该 DNA 的长度应能够装入 λ 噬菌体颗粒或黏粒载体。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。
实验方法原理 | 直到 20 世纪 80 年代中期,尚无技术可用于基因组 DNA 黏性大片段的分离、扩增和分析。在此之前,如果要对某一 DNA 片段进行详细的物理和功能研究,该 DNA 的长度应能够装入 λ 噬菌体颗粒或黏粒载体。 |
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实验材料 | 酿酒酵母 |
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试剂、试剂盒 | 甘油 |
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仪器、耗材 | 脉冲场凝胶电泳仪选择性培养基YPD 琼脂平板YPD 培养基试管 |
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实验步骤 | 一、材料
1. 缓冲液和溶液
用 YPD 培养基配制的 30% (V/V) 的甘油
2. 凝胶
脉冲场凝胶电泳仪
3. 培养基
选择性培养基
YPD 琼脂平板
YPD 培养基
4. 专用设备
试管(2 ml )
5. 载体和酵母菌株
携带重组 YAC 克隆的酿酒酵母
二、方法
1. 实验室获得克隆后,立即划线接种于选择培养基中,30℃ 培养 48 h 以获得单个菌落。
2. 挑取 6~12 个单菌落,分别加入 10 ml YPD 培养基中。将培养物在 30℃ 剧烈振荡 ( 300 r/min ) 培养过夜。在此期间,细菌数应达到饱和(OD600=2.0~3.0,约为 3 X 107 个细胞/ml)。
3. 分别从每一培养物中取 9 ml,提取酵母 DNA。
4. 用 PFGE 分析每一个 DNA 产物中 YAC 的大小。
5. 用 Southern 杂交或 PCR 确定 YAC DNA 中存在靶序列。
6. 如果结果满意,即培养液中含有的 YAC 大小相同,没有不稳定或重排的迹象,并且靶序列也存在,则可以选择 1~2 个培养物长期保存。
![](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2015/10/B1445587450png_small.jpg) |
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