动物受到病毒感染后,体内产生特异性中和抗体,并与相应的病毒粒子呈现特异性结合,因而阻止病毒对敏感细胞的吸附,或抑制其侵入,使病毒失去感染能力。中和试验 (Neutralization Test)是以测定病毒的感染力为基础,以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据,来判定免疫血清中和病毒的能力。
实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 一、试验目的 1. 标本
(1) 毒株 汉滩病毒标准株 76-118,汉城病毒标准株 Seoul; (2)标准血清 兔抗汉滩病毒、汉城病毒血清; (3)空斑减少中和试验常用试剂。 三、步骤 1. 将待检血清用牛血清Hanks 氏液稀释成1:10,56℃灭活30分钟; 2. 进一步2倍稀释血清成1:20、1:40、1:80……,对照血清1:10稀释; 3. 稀释两种病毒(在冰浴中进行)至含200 pfu/ml; 4. 各连续稀释度血清分别与200 pfu/ml的两种病毒液等量混合(各0.3 ml),置37℃中作用1小时(每15分钟振荡一次); 5. 吸出各细胞培养孔中维持液; 6. 接种长满单层的Vero-E6细胞(24孔板),每孔接种血清病毒混合液、标准血清对照及两种病毒对照 ,每稀释度两孔,100 ul/孔。37℃吸附1小时,每隔15分钟摇动一次; 7. 加第一层琼脂糖覆盖液(需冷置42℃左右),每孔1 ml,室温下待凝固,细胞面朝上,置37℃5%CO2孵箱培养7-9天; 8. 加第二层含中性红琼脂糖覆盖液,1 ml/孔,室温下待凝固,细胞面朝上,置37℃5%CO2孵箱培养2-5天,从第二天开始观察空斑数; 9. 抗体滴度的判定,以比病毒对照的空斑数中和或减少50%的血清最高稀释度倒数判为待检血清中和抗体滴度; 10. 型别判定:根据同一份血清与两种病毒的反应滴度不同来区分,如果一份血清与汉滩病毒 (或汉城病毒)反应的抗体滴度高于与汉城病毒(汉滩病毒)的抗体滴度4倍或以上,即判为汉滩病毒型,反之则为汉城病毒型。两者滴度相差无几时,则不好分型。不足4倍时亦不能定型。 四、配方 1. 第一层琼脂糖覆盖液
2. 第二层琼脂糖覆盖液 基本上同第一层琼脂糖覆盖液,仅将灭活胎牛血清改为5 ml,另加中性红溶液1 ml(333.0 ug/L中性红钠盐Gibco)。 展开 |