人非小细胞肺癌裸鼠原位种植转移模型的建立:(1)探讨肺癌远处转移和阻断其远处转移的研究;(2)模拟晚期非小细胞肺癌转移的自然发生过程;(3)在活体动物的完整器官内评估瘤细胞播散和肿瘤的生长。
实验方法原理 | 将表达GFP的质粒pRNAT-U6/Neo转染人肺腺癌细胞A549,G418筛选获得稳定表达GFP细胞,对比转染前后细胞的生长活性和成瘤性。将转染后细胞原位种植裸鼠预定标准处死。HE染色和免疫组化检测转移灶的位置和数目。利用KODAK IS2000MM系统检测肿瘤播散情况。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | 小牛血清RPMI-1640培养液pRNAT-U6 Neo磷酸钙即用型SP超敏 感免疫组化染色试剂盒DAB Kit 显色试剂盒甲醛EDTA戊巴比妥钠 |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 一、实验材料准备
3. 质粒和筛选药物质粒pRNAT-U6/Neo(美国Genscript公司),携带Neomycin耐药基因供筛选,在CMV启动子控制下编码cGFP作为转染标记物。G418(美国Promega公司)800 μg/ml初筛后200 ug/ml维持筛选。
二、细胞的转染
三、人肺腺癌A549裸鼠原位种植模型的建立 1. 取转染后细胞,用不含血清的RMPI 1640培养液冲洗2次并调整细胞最终浓度为5x106/0.2 ml备用。 四、检查项目 1. 转染后细胞荧光显微镜成像转染后24~48 h荧光显微镜下观察,确认转染成功。单克隆化过程中镜下观察细胞克隆生长情况。 2. 活体GFP标记成像检测应用KODAK IS2000MM进行活体荧光成像,确认注射部位为胸腔,后间断应用以活体确认瘤细胞的远处转移。 3. 解剖学与组织学检查处死的裸鼠均经 详细解剖学检查,取出器官、固定包埋后,以4 tun厚度连续切片,切片严格编号,奇数号行HE染色,光镜观察,以初步确定转移灶。 4. 免疫组织化学染色 选择肺脏、肝脏和脑作为主要研究器官,在HE染色确定转移灶位置的基础上,取相邻偶数号码的切片进行免疫组化检测,CEA鼠抗人单克隆抗体(ZM-0062),LRP鼠抗人单克隆抗体(ZM.0335)工作液,即用型SP超敏感免疫组化染色试剂盒(sP-9000)、抗原修复液、DAB Kit显色试剂盒(zU一9032)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 五、统计学处理 |
注意事项 | 原位种植时应遵循严格的生物安全标准,避免细菌污染。 |
其他 | 原位种植法模拟肺癌发生的自然环境,是建立肺癌转移模型的最佳方法。肿瘤学研究中应用最多的皮下种植法建立的模型只是局部包块而无远处器官的转移和播散,不出现肿瘤相关症状。胸腔内原位种植法操作简便,重现临床NSCLC转移过程;GFP转入人肺腺癌A549细胞对生长活性和致瘤性无影响,A549/GFP用于NSCLC转移模型结果可靠;借助于荧光显像设备,利用GFP的示踪功能可以非侵人性检测NSCLC转移。 |