基本方案
实验方法原理 | |
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实验材料 | 纯化的痘苗病毒 |
试剂、试剂盒 | Tris•Cl 溶液 SDS 蔗糖溶液 蛋白酶 K 用 50 mmol/L Tris • Cl 溶液平衡的苯酚 1:1苯酚氯仿 1 mol/L 乙酸钠 乙醇 |
仪器、耗材 | 分光光度计 Sorvall 离心机 |
实验步骤 |
1. 在 260 nm 处确定纯化的疸苗病毒的光密度,将 20 个光密度单位的病毒(见「痘苗病毒纯化实验」 步骤 24)加入到 50 mmol/L pH 7.8 的 Tris • Cl 缓冲液中,终体积为 1.2 ml。 2. 将以下溶液加到病毒悬液中(终体积为 2 ml): 0. 1 ml 1 mol/L pH 7.8 的 Tris • Cl 0.1 ml 10% SDS 0.2 ml 60% 蔗糖溶液 0.4 ml 10 mg/ml 蛋白酶 K 37℃ 温育 4 h。 3. 用苯酚抽提 2 次,每次加入等体积的平衡苯酚,摇动离心管轻轻混匀,室温,300 g 离心 10 min,用去掉头部的枪头将上层水相吸出保留。 4. 用步骤 3 所述的方法,再用 1:1 的苯酚氯仿抽提 1 次。 5. 加入 1/10 体积的 1 mol/L pH 7.0 的乙酸钠和 2.5 体积的 100% 乙醇。轻轻混匀,并在 -20℃ 冷冻几个小时。 6. 以最大的速度 4℃ 微量离心 10 min,吸弃上清。 7. 用 95% 乙醇清洗沉淀 2 次,每次加入乙醇后以最大速度微量离心,吸出上清。空气干燥后用 100 μl 的水溶解。 8. 制备稀释液(仅取一小部分),用 A260 测定 DNA 浓度。
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注意事项 |
在本操作中不要涡旋 DNA。因为痘苗病毒的基因组很大,如果想得到完整长度的 DNA(如用于限制酶切分析)就必须小心操作,以免剪切 DNA。 |