质粒DNA的大量提取和纯化实验

STE 酚 氯仿 NaCl PEG 乙醇

离心管 离心机 抽干机

1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250 ml，4 ℃下5000 g离心15分钟,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。

2、将细菌沉淀重新悬浮于50 ml用冰预冷的STE中（此步可省略）。

3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。

4、将细菌沉淀物重新悬浮于5 ml溶液I中,充分悬浮菌体细胞。

5、加入12 ml新配制的溶液II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴10分钟。

6、加9 ml用冰预冷的溶液III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置15分钟,此时应形成白色絮状沉淀。

7、4 ℃下5000 g离心15分钟。

8、取上清液,加入50 ml RNA酶A(10 mg/ml), 37 ℃水浴20分钟。

9、加入等体积的饱和酚/氯仿,振荡混匀,4 ℃下12000 g离心10分钟。

10、取上层水相, 加入等体积氯仿,振荡混匀,4 ℃下12000 g离心10分钟。

11、取上层水相,加入1/5体积的4mol/L NaCl和10% PEG(分子量6000), 冰上放置60分钟。

12、4 ℃下12000 g离心15分钟, 沉淀用数ml 70%冰冷乙醇洗涤，4 ℃下12000 g离心5分钟。

13、真空抽干沉淀，溶于500 ml TE或水中。