实验方法原理 |
氯霉素乙酰转移酶报告基因(chloramphenicol acetyltransferase, CAT)能将乙酰基从乙酰辅酶A转移到氯霉素上。本试剂盒采用荧光测定的方法,检测CAT活性,它的灵敏度接近同位素测定方法,而操作极为简便、快捷,成本也大为降低。使用通用裂解缓冲液,能与其他类型的报告基因检测和蛋白含量检测兼容。 |
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实验材料 | 细胞样本 |
试剂、试剂盒 | Tris-缓冲液 Tris 三硝基甲苯(Triton) CAT 稀释缓冲液 CAT 酶标准物 闪烁液 聚丙烯闪烁杯 |
仪器、耗材 | 微量离心管 微量离心机 |
实验步骤 |
一、材料
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注意事项 |
1. 在表达质粒扩增与制备一步,要特别注意其纯度(不能含RNA和染色体DNA)以免影响转化效率 2. 制备方法最好选用溶菌酶加Triton10,然后氯化艳梯度离心。 3. 一定要有对照组用CAT酶代替细胞提取液,来验证反应及层析等过程的可行性,或用Psv:CAT和Psv。cAT表达质粒验证转化及重组两步的正确性。 4. 在制备细胞提取液中最好选用超声波破碎法,离心前要注意检查破碎程度。冻融法繁琐有时破碎不彻底影响结果。 5. 4mmol/L乙酞辅酶A可每次取1.smg溶在500川水中,最好用前配制,配制的溶液可保存于一20℃,但不可超过十天。
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其他 |
成功地组装表达质粒是该项检测技术的关键之一,表达DNA质粒必须具有下列几种元件:(1)供细胞复制的原核编码顺序和供啼选用的标记基因(抗菌素基因);(2)控制真核细胞转录的调控元件(增强子、启动子);(3)控制转录后的一些信号,转录加工裁剪信号,加尾信号,供在哺乳动物表达中用;(4)未知待测基因顺序可取代上述的转录调控顺序;(5)标记基因(氯霉素乙酸转移酶)。 参考: 展开 |