试剂、试剂盒 Tris-缓冲液 Tris 三硝基甲苯（Triton） CAT 稀释缓冲液CAT 酶标准物闪烁液 聚丙烯闪烁杯
仪器、耗材 微量离心管微量离心机
实验步骤
一、材料
灭菌物品
1. D-PBSA
2. 多孔培养板：6 孔，35 mm
非消毒物品
1. Tris-缓冲液：Tris-HCl，0.1mol/L，pH8.0
2. Tris/三硝基甲苯（Triton）：Tris-HCl，0.1mol/L，pH8.0，0.1%TritonX-100,4℃ 储存
3. CAT 稀释缓冲液：Tris-HCl，0.1mol/L，pH8.0，50% 甘油，0.2%BSA
4. 底物：含 250 mmol/L 氯霉素（GIBCO）的 100% 甲醇；分装，-70℃ 储存
5. 14C-CoA：14C-丁酸辅酶 A（10μCi/mL；AmershamPharmacia）
6. CAT 酶标准物：制备含 0.2、1.0、2.0、4.0、10U/mL 标准液的 CAT 稀释缓冲液，4℃ 储存
7.「鸡尾酒」闪烁液：Econofluor（Invitrogen）
8. 去离子蒸馏水（DDW）
9. 聚丙烯闪烁杯：3.5 mL
10. 微量离心管
11. 微量离心机
12. 冰浴
方法A：6 孔、35 mm 培养板上的细胞收集
1. 转染后 24~72 h，用 D-PBSA 液洗涤细胞。
2. 将培养板置于冰上，每孔中加入 1 mL 的 Tris/Triton。
3. 将培养板-70℃ 冷冻 2 h。
4. 于 37℃ 下解冻培养板，然后将其置于冰上。
5. 将细胞裂解物移至微量离心管中，以最大速度离心 5 min。
6. 收集上清液，65℃ 加热 10 min，以灭活 CAT 抑制物质。
7. 最大速度离心 3 min 后收集上清液（细胞裂解物），将上清液保存在-70℃。
方法 B：CAT 测定
8. 从每一样品中取 5~150μL 细胞裂解物，移至一个 3.5 mL 多聚丙烯闪烁杯中，并且加入足够的 0.1mol/L Tris，终末体积为 150μL。
9. 设空白杯，加入 150μL 0.1mol/LTris 液，作为阴性对照。
10. 阳性对照：
（a）取 5 个闪烁杯，各加入 150μL 0.1mol/LTris。
（b）将 5μL 的 CAT 标准液加入到每个闪烁杯中，绘制 1、5、10、20、50mU 的 CAT 标准曲线。
11. 在所有样品杯（包括对照）中，加入 100μL 以下混合液：
（a）84μL 超纯水
（b）10μL 0.1mol/LTris
（c）1μL 的氯霉素
（d）5μL（50nCi）的 14C-CoA
12. 拧紧杯盖，于 37℃ 下孵育 2 h。
13. 向所有闪烁杯中加入 3 mL Econofluor，拧紧杯盖。
14. 上下倒置混匀闪烁杯中成分。
15. 室温下孵育 2 h。
16. 在一个液闪计数仪上测定 30s 闪烁次数。
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