菌落PCR，快速鉴定重组质粒

质粒快速鉴定   

试剂：

Protoplasting buffer:

30mM Tris-HCl, pH8.0                    0.33ml/1.0M

       5mM EDTA                                0.1ml/0.5M

       50mM NaCl                               0.1ml/5.0M

       20% Sucrose                              5ml/40%

       50 µ g/ml RNAseI                          50ul/10mg/ml

       50 µ g/ml lysozyme                       50ul/10mg/ml

补水至10ml，-20℃分装保存。

  Lysis buffer:

89mM Tris-HCl, pH8.0

89mM boric acid               2ml of 5×TBE

2.5mM EDTA

2% SDS                         2ml of  10%

5% sucrose                     1.25ml of 40%

0.04% bromphenol blue         4mg

补水至 10ml ， - 20℃分装保存。

步骤：

1 ．将转化后的菌液铺平板， 37 ℃ 过夜培养。

2 ．配制 0 .6--0 .7% 的琼脂糖 TBE 胶。

3 ．用连续加样枪在 96 孔板中每孔加入 10 µ l Photo plasting Buffer 。

4 ．用灭过菌的 10ul 小枪头挑取单克隆白斑至含有 Photo plasting Buffer 的 96 孔板中，振荡混匀。

5 ．用连续加样枪将 Lysis Buffer 上样于凝胶中，每孔 4 µ l ，用排枪将细胞与 Protoplasting buffer 混合液 上样于凝胶中（细胞在 Protoplasting buffer 中不宜超过 30-40 min ），并点上Marker 。

6 ．调节电压为 20V （小槽）或 40V （大槽），电泳 15min ，使细胞充分裂解，将电压调高到 200V ，继续电泳 1hr ，照相。

7 ．根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。

2 ．菌落 PCR

1．取适量PCR薄壁管，置于冰上，每管先加入17.3ul的灭菌水。

2．用灭过菌的10ul小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中， 振荡混匀。

3．依次加入：

                 10xbuffer         2.5            

Mgcl₂ (25mM)           1.8

DNTP(2.5mM)           1         

T3 引物（10pmol）  1             

T7 引物（10pmol）  1        

Taq酶            0.4     

total            25ul    

各试剂均加好后，离心机上甩一下，使之沉底，置于PCR仪上

4．94℃，2min。

5．            94℃      4分钟

94℃      40秒

53.6℃    40秒      35个循环

72℃      4分钟

72℃      10分钟

4℃       24小时

6．待PCR反应进入4℃后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰跑电泳，同时上1Kb DNA ladder。半小时后照相，观察胶图， 根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。

7．将快速鉴定和菌落PCR检测合格的文库送检。