荧光素酶检测设定
试剂盒中的试剂使用前需在室温下孵育。向装有2 . 2 m g 冻干底物的小瓶中加入220μL水混匀后即为萤火虫酶底物。向装有440μg冻干底物的小瓶中加入220μL水混匀后即为水蛭素肠杆菌素。用萤火虫检测缓冲液按1:50比例稀释萤火虫酶底物后即为萤火虫工作液。用海肾荧光素酶缓冲液按1:50比例稀释水蛭素肠杆菌素后即为海肾工作液。对一个96孔板来说，每种工作液(working solution)我们需要11mL，其中包含220μL各自的底物(substrate)。SoftMax® Pro Software中预配置的程序可以帮助执行实验操作和结果分析，这需要以下的参数设置：
1、使用注射器1向孔中加入100μL萤火虫工作液
2、等2秒钟使反应充分
3、设置integration time 5秒检测萤火虫荧光
4、使用注射器2向孔中加入100μL海肾工作液
5、等2秒钟使反应充分
6、设置integration time 5秒检测海肾荧光
7、对每个实验孔，需要将第一次测量(firefly荧光)与第二次测量(海肾荧光)的RLU值相比获得数据。
SpectraMax iD5注射器模块和SmartInject技术可以在加入试剂的过程中进行震荡，从而保证试剂充分混匀以最大限度的获得萤火虫和海肾的荧光信号。
表2 在诱导与不诱导情况下不同转染条件下获得的比值。最好的条件是转染试剂：DNA为2.5:1。
结果
相对于诱导条件的变化而言，各种转染条件均能检测到海肾荧光素酶的高表达，而加入细胞因子TNF-α会大大增加萤火虫荧光素酶的表达水平(图2)。总之，转染试剂与DNA比例为2:1时荧光素酶的表达水平较其他比例而言最低。结果显示诱导条件下，三种转染比例条件下萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶均一化读值较高(图3)。然而均一化比值在3:1和2.5:1的转染条件下较低，但是加TNF-
α诱导的与不加的倍比关系明显较大。表2显示三种转染条件下诱导的倍比关系，最好的诱导倍比条件是试剂： DNA比例为2.5:1。
结论
在HEK293细胞系应用双报告基因检测法，我们证实了加入TNF-α强烈诱导NF-κB的表达。由于此系统对萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶都敏感，都可得到较强的信号。三种转染条件下，我们加入TNF-α诱导使NF-κB均一化后的最佳比值可达到54倍。
使用SpectraMax® iD5 多功能微孔板读板机、具有SmartInject™ 技术的注射器系统，可用于检测SpectraMax® DuoLuc™Reporter 实验。预置的操作流程简化了数据采集和分析的操作。SpectraMax Pro软件可助你快速完整、灵敏可靠的获得双荧光素酶报告系统的检测结果。
Reference
1. Oeckinghaus, A and Ghosh, S. The NF-κB Family of Transcription Factors and Its Regulation.
Cold Spring Harb Perspect Biol. 2009 Oct; 1(4): a000034.
首页
