Western印迹法（试剂配制和操作步骤）（上）

这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。 Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。

仪器：高压锅、电动匀浆机、高速离心机、垂直板电泳转移装置、脱色摇床。

试剂：单去污剂裂解液、分离胶、4％浓缩loading、G250考马斯亮蓝溶液、5XSDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、显影液、定影液、抗体、ECL化学发光试剂。

杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，口罩，保鲜膜，X-光片夹，X-光片，计时器，吸水纸。

试剂配制：

（一）母液

34.8mg/ml (200mmol/L)PMSF
          PMSF          0.348g
          异丙醇         10ml

溶解后，－20℃保存。

10％SDS
             SDS                   5g
           蒸馏水至               50ml

50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。

5mol/LNaF氟化钠
                  氟化钠               2.1g
                  超纯水                10ml

溶解后，-20℃保存。

100mmol/L 激活矾酸钠
                  偏矾酸钠             0.122g
                  超纯水                8ml

加浓盐酸调节pH至10（颜色变黄），80℃左右热水浴至溶液无色，室温冷却，重调pH至10，重复热水浴和调整pH的操作至溶液保持无色，定容10ml，-20℃保存。

1.0mol/L Tris•HCl（pH8.0）
                  Tris (MW121.14)         1.212g
                   超纯水                         8ml

溶解后，用浓盐酸调pH至8.0，最后用超纯水定容至10ml，高温灭菌后室温下保存。

10％过硫酸胺（AP）
                  过硫酸胺             0.1g
                  超纯水                1.0ml

溶解后，4℃保存，保存时间为2周。

1.5mol/L Tris•HCl（pH8.8）
                  Tris (MW121.14)         45.43g
                   超纯水                         200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

0.5mol/L Tris•HCl（pH6.8）
                   Tris (MW121.14)         0.606g
                   超纯水                          8ml

溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至10ml，高温灭菌后室温下保存。

30％Acr/Bic（29：1）

丙稀酰胺（Acr）                14.5g
甲叉双丙稀酰胺（Bic）         0.5g
超纯水至                           50ml

37℃下溶解后，4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。

20％Tween20
Tween20          10ml
蒸馏水至          50ml

Tween20比较粘稠，需将大枪头前端剪掉，将吸口扩大，吸取和移液时应缓慢，避免液体挂壁，混匀后4℃保存。