ELISPOT 实验方案
对应BD的试剂盒
实验材料的准备
试剂盒中没有但是必须的
材料:
• 已消毒的移液器 (Gilson)。单道20ul,100ul,200ul,1ml, 8/12道200ul
• 无菌一次性聚苯乙烯吸量管 (1ml, 5ml, 10ml)(Axygen)。
• 一次性乳胶手套 。
• 无菌一次性离心管(15ml、50ml)(Corning cat#430052 and 430290)。
• 吸水纸(卫生纸)
• 无菌tip头, 200ul,1ml,
试剂:
1. PBS 无菌 300ml/10板,有菌4000ml/10板 在准备包被抗体时不要使用商业化的PBS
2. ddH2O(无菌) 对于10块ELISPOT板,200 ml
3. 有菌洗涤缓冲液(PBST):有菌3000ml/10板
Tween-20 进口
4. 有菌洗涤缓冲液(PBS):有菌1000ml/10板
5. 培养液:无血清培养基 (P/S, 2 mM 的谷氨酰胺,以及 Hepes buffer)。
6. PMA +ionomycin.
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA; Sigma Chemical Co., product nr. P8139 is recommended).
PMA
贮 存 液:PMA溶于DMSO,浓度为1mg/ml,-20℃保存
工 作 液:贮存液 1:4000稀释于无血清培养基中
此时为 250ng/ml
Calcium ionophore (ionomycin; Sigma Chemical Co, product nr. I0634 is recommended).
Ionomycin
贮 存 液:Ionomycin溶于DMSO,浓度为1mg/ml,-20℃保存
工 作 液:贮存液 1:200稀释于无血清培养基中
此时为 5μg/ml
50ml混合刺激剂=PMA工作液12.5ul,Ionomycin工作液250ul,无血清培养基补齐
7. 10% 热灭活胎牛血清 (Hyclone cat# ALH14384 )
8. 抗原
设备:
• 洗板器: 自动或手动 (洗瓶, 手动分液器等)。
•专用CO2-细胞培养箱 (37°C)。
4°C冰箱
无菌间无菌操作台
Preparation kit reagents
1.包被用抗体
取50 μl加到10ml PBS中。(足够包被1块96孔板,100 μl/well)。
对10块板子, 500ul加到100ml PBS中
2.生物素标记的检测抗体(detector antibody)
取50μl加到10 ml Dilution buffer中。(混匀后加入ELISPOT板,100 μl/well)。
对10块板子, 500ul 加到100ml Dilution buffer(PBS+10%FBS)
3.STREP-HRP
取100μl加到10 ml Dilution buffer中。(混匀后加入ELISPOT板,100 μl/孔)。
对10块板子, 1ml 加到100ml Dilution buffer
4 显色激活系统(Activation system)
对于1块ELISPOT板,200ul AEC Chromogen + 10 ml AEC Substrate,混匀,10分钟内用完。(100 μl/孔)。
ELSPOT实验步骤
Day 1
包被ELISPOT板 16:30
1. 在ELISPOT板中每孔加入包被抗体100μl,4℃ 过夜。
Day 2
ELISPOT板的封闭 17:00
2. 取出已包被的ELISPOT板,吸弃每孔中的包被抗体溶液。
3. 用完全无血清培养基洗1次。
4. 在ELISPOT板中,每孔加入200μl完全无血清培养基。室温2h。(8道排枪)
5.
PBMC加入ELISPOT培养板 20:00