6. 取出封闭2h的ELISPOT板,吸弃每孔中的封闭液。(不要洗板!)
7. 在ELISPOT板中,先加30μl 无血清培养基(12道排枪)和20μl肽库(8道排枪),后加50μl细胞(8道排枪) (每孔活细胞总数为2×105,每个病人需活细胞总数为10×106,体积为2.5 ml。每条多肽的终浓度为5μg/ml,活细胞的工作浓度为4×106/ml,活细胞的终浓度为2×106/ml)。
阳性孔中每孔加入50μl 细胞和30μl无血清培养基和20μl PMA+Inomysin(工作液浓度分别为250ng/ml和5ug/ml,终浓度分别为50ng/ml和1ug/ml)。
8. 用low evaporation lid 盖好ELISPOT板,放入37℃ CO2孵箱培养30 h。
注意:不要晃动ELISPOT板。
Env1 | Pol1 | Pol1 | Vif | Vif | Env1 | Env1 | Pol1 | Pol1 | Vif | Vif | |
Env2 | Env2 | Pol2 | Pol2 | 阴对 | 阴对 | Env2 | Env2 | Pol2 | Pol2 | 阴对 | 阴对 |
样本 1 Env3 | Env3 | Pol3 | Pol3 | 阴对 | 阴对 | 样本2 Env3 | Env3 | Pol3 | Pol3 | 阴对 | 阴对 |
Env4 | Env4 | Pol4 | Pol4 | 阴对 | 阴对 | Env4 | Env4 | Pol4 | Pol4 | 阴对 | 阴对 |
Env5 | Env5 | Pol5 | Pol5 | 阴对 | 阴对 | Env5 | Env5 | Pol5 | Pol5 | 阴对 | 阴对 |
Gag1 | Gag1 | Nef | Nef | 阴对 | 阴对 | Gag1 | Gag1 | Nef | Nef | 阴对 | 阴对 |
Gag2 | Gag2 | Tat REV | Tat REV | 样本阳对 | 样本阳对 | Gag2 | Gag2 | Tat REV | Tat REV | 样本阳对 | 样本阳对 |
Gag3 | Gag3 | Vpu Vpr | Vpu Vpr | 样本阳对 | 样本阳对 | Gag3 | Gag3 | Vpu Vpr | Vpu Vpr | 样本阳对 | 样本阳对 |
Day 4
二抗和GABA标记,显色反应 8:30
9. 培养30h后,取出ELISPOT板,甩去细胞后。
10. 用去离子水洗涤2次。每次浸泡5分钟。
11. 用0.05%PBST洗涤3次。每次浸泡2分钟。
12. 每孔加入100μl 生物素化的detector Ab(8道排枪)。室温2小时。
13. 取出ELISPOT板,倒去detector Ab溶液,用PBST洗涤3次。每次浸泡2分钟
每孔加入100μl Strep-HRP溶液(8道排枪)。室温1小时
14. 取出ELISPOT板,倒去Strep-HRP溶液。
15. PBST洗涤4次。每次浸泡2分钟。
16. 用PBS洗涤2次。每次浸泡2分钟。
17. 洗涤完毕后,在吸水纸上轻轻拍干ELISPOT板。
每块板子200ul AEC Chromogen + 10 ml AEC Substrate,混匀,15分钟内用完。
18. 每孔加入100 µl 配好的substrate(8道排枪)。在暗处、室温下孵育(5~60分钟)。
出现斑点后,用自来水冲洗,中止反应。室温下干燥,检测。