例4:肝细胞的不连续密度梯度分离
这种方法适用于从肝窦状细胞(Sinusoidal)中除去红细胞和主质细胞(parenchymal),离心结果是让红细胞沉淀,内皮细胞(Sinusoidal)浮上。
实验需要的基本设备和溶剂:
l 一台带甩平转头的低速、低温离心机;
l GBSS;
l 在无NaCl的GBSS中的28.7% Nycodenz或 30% metrizamide
l 15ml塑料离心管;
l 窦状(Sinusoidal)肝细胞;
l Trypan蓝染色剂;
l 过氧化物酶染色剂,及染色需要的设备;
l 生理盐水(0.9% NaCl);
l 固定液:2.5%戊二醛在0.1M二甲基胂酸钠中(PH7.4)(二甲基胂酸钠有剧毒,可用0.1M磷酸盐代替)
l 培养液:(在通风柜或生物安全柜中配置)
9.5ml 1.0M NaCl;
11mg 1-乙酸萘脂在0.5ml乙基乙二醇-乙醚中(在氮气中保存);
0.5ml 1.0M NaCl;
0.25ml 4% 品红在2.0M HCL中,0.25ml 4% 硝酸钠在纯水中,共计0.5ml混合;
把以上混合液调节到PH7.4,纤维纸过滤后待用;
注意:30分钟内用完!
离心方法:
i. 准备10ml Sinusoidal肝细胞在GBSS中悬液(1~4×108个细胞);
ii. 在悬液中加14ml28.7%(W/V)Nycodenz 或30%(W/V)metrizamide 轻轻混匀;
iii. 将以上溶液分别注入二个离心管,并在每管液面上缓铺1-2ml GBSS;
iv. 离心:400gx15分,室温,不用刹车,自由滑行减速至停转;
v. 从GBSS 与梯度液之间慢慢地抽吸Sinusoidal 细胞
vi. 用例2 同样的方法测定细胞数量和活力。
vii. 酯酶染色反应
l 数滴细胞悬液(~0.5×106 个细胞)滴入1~2ml 固定液,4℃,7 分钟
l 700g×3 分,低速离心后,去上清,沉淀用0.9%Nacl“洗”二次(在离心机中,700g×3
分“洗”2 次)
l 取“洗”后沉淀与200μl 0.9% Nacl 作成悬液,加入等容积培养液,37℃培养染色10 分
钟
l 用血球计数器测定染色百分比:Kupffer, endothelial 及Parenchymal 细胞染成红色,红
细胞及淋巴细胞不被染色,储脂细胞微染。
l 结果可用下表表示
项目 | Nycodenz | metrizamide | |
细胞产率 | 43×106 | 44×106 | |
细胞活力 | 99% | 99% | |
细胞化学染色 | 过氧化物酶染 | 17% | 27% |
酯酶染 | 71% | 80% | |
细胞组成: | Kupffer | 16% | 26% |
endothelial | 54% | 54% | |
储脂细胞 | 10% | 1% | |
红细胞 | 1% | 1% | |
主质细胞 | 1% | 1% | |
其他细胞(如淋巴细胞) | 18% | 18% |
例5:用双阶梯不连续梯度部分纯化储脂细胞,需要的设备和化学试剂同例3。
i. 从一只成年雌鼠取肝制成Sinusoidal 细胞悬液(1~4×108 个细胞在12ml GBSS 中)
ii. 以6 倍容积的28.7%(W/V)Nycodenz 或30%(W/V)metrizamide 配以4 倍容积的
GBSS 来稀释梯度液。取二个离心管(15ml),每管注入5ml 已稀释的梯度液(17.2%
Nycodenz 或18%metrizamide)
iii. 将8ml 未稀释的梯度原液与12ml 细胞悬液i 轻轻混合,混合后溶液中梯度液浓度为
11.5%Nycodenz 或12%metrizamide
iv. 每个离心管液柱上铺5ml 已稀释的细胞悬液与梯度液(iii 液),再在液面上铺1~2ml
GBSS 形成双阶梯不连续密度梯度。
v. 低速离心1400g(2,700~2,800rpm)×17 分,20℃,无刹车,自由滑行至停转。
vi. 用吸管从二个离心管的低密度界面及高密度界面上分别抽出细胞层。
vii. 用与例3 同样的方法测定细胞产率、活力及组成并作成下表:
细胞名称 | 细胞组成 | |||
低密度片断 | 高密度片断 | |||
细胞数量(×106) | % | 细胞数量(×106) | % | |
储脂细胞 | 52.5 | 79.6 | 0.9 | 0.4 |
Kupffer | 0.7 | 1.0 | 45.5 | 20.3 |
endothelial | 10.9 | 16.6 | 129.7 | 57.9 |
其他细胞(如淋巴细胞) | 1.9 | 2.8 | 47.9 | 21.4 |
总计 | 66 | 100 | 224.0 | 100 |