例7 鼠肝主质细胞的多倍体级浮选分离 l 设备及样品:同例(5) l 转速1350rpm(~210g) l 温度4℃ l 初始充样流速12ml/min,直至细胞充满离心室 l 分别用流速19,32,41(ml/min)收集I,II,III 细胞,收集量分别为100ml,150ml 及100ml l 已收集细胞储存于4℃ l 停止输液后转头停转,从离心室收集沉淀并收集混合室样品 l 用低速低温离心机甩平转头分别将收集液离心沉淀,1000×g,10 分钟,将沉淀与3ml 浮选介质混合制成倍体细胞悬液,4℃保存。 l 结果:细胞数量与活性分析
成分 | 流量ml/min | 细胞数量×106 | 活性(%) | 组成 |
原液 | 137.8 | 84 | 2n,4n,8n,16n 及少量细胞聚集团及细胞碎片 | |
I | 19 | 39.8 | 72 | 2n,4n, 少量细胞碎片 |
II | 32 | 54.7 | 85 | 4n(90%) |
III | 41 | 15.5 | 83 | 4n,8n,细胞聚集团 |
沉淀 | 17.1 | 82 | 同原液数据 | |
混合室 | 5.2 | 85 | 同原液数据 | |
总数 | 127.0(92%) |
例8 肝的Kupffer (星形细胞)及endothelial( 内皮)细胞纯化 l 浮选设备:同上述例 l 浮选用介质:GBSS l 各种染色介质(参考各节) l 肝窦状细胞(Sinusoidal)悬液 l 分离步骤
i. | 用不连续Nycodenz 梯度制备鼠肝Sinusoidal 细胞悬液(参见本文前例) |
ii. | 安装离心浮选系统(Hitachi 或Beckman) |
iii. | 标准离心室:3,250rpm,4℃ |
iv. | 初始流量13.5ml/min 注入1~5×108个细胞悬液 |
v. | 在流量分别为18,32,48ml/min 时分别收集100ml,150ml,150ml |
收集液中含有白细胞(L)、星形细胞(K)、内皮细胞(E)及主质细胞(P),收集 | |
液保存在4℃。 | |
vi. | 离心后收集在浮选室中的细胞 |
vii. | 各种收集液离心沉淀:450g×10 分,沉淀分别混悬于3mlGBSS 中 |
viii. 结果如下表:
成份 | 细胞主要类型 | 细胞总量×106 | 活性 | 染色细胞比例% | 组成% | ||||
% | P1 | E1 | P | L | E | K | |||
初始细胞液 | Sinusoidal | 167.4 | 87 | 24.7 | 86.8 | 0.6 | 13.2 | 61.5 | 24.7 |
I 收集液(100ml) | L | 19.9 | 80 | 3.0 | 28.6 | / | 71.4 | 25.6 | 3 |
II 收集液(150ml) | E | 82.5 | 95 | 9.0 | 89.2 | / | 10.8 | 80.2 | 9 |
III 收集液(150ml) | K | 34.7 | 97 | 83.5 | 95.1 | / | 4.9 | 11.6 | 83.5 |
沉淀 | 细胞聚集团 | 9.8 | 95 | 34.5 | 96 | 16.0 | 4.0 | 44.6 | 35.4 |
注: l 表成染色比例中 P1:Peroxidase 过氧化物,E1:Esterrase(酯酶) l Sinusoidal 细胞制备方法参见前述内容。 例9 鼠肝储脂细胞的离心浮选纯化(文献14)
i. | 离心浮选设备(同上) |
ii. | 转速3,250rpm,4℃,流量16ml/min |
iii. | Sinusoidal 细胞制备参照前述二阶不连续梯度离心法。 |
iv. | 加样:5~50×107 个细胞注入混合室 |
v. | 用16ml/min 及18ml/min 分别收集二次,最后收集在离心室中剩下的细胞液 |
vi. | 以上三种收集液分别450g×10 分钟离心,收集沉淀后分别用2mlGBSS 混成 |
悬液 |