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R&D Systems试剂 Q&A 常见问题解答(二)

2020.7.14
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王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

 

细胞凋亡

 

问:为什么有两套不同的TUNEL试剂盒?

答:因为有两种不同的TUNEL方法可检测细胞凋亡。第一种方法采用TdT酶(末端脱氧核苷酸转移酶)将生物素化的核苷酸加到组织中的DNA片段的3'-羟基端。加入正离子可使这种标记更有效,经生物素化的核苷酸可用streptavidin-HRP共轭物和底物来检测。

第二种方法仍采用TdT酶(末端脱氧核苷酸转移酶)将核苷酸加到样本中的DNA片段的3'-羟基端,但采用5-溴脱氧尿苷(BrdU)标记而非生物素,再用生物素化的抗5-溴脱氧尿苷(BrdU)抗体来检测。采用这种方法的细胞凋亡检测试剂盒包括:TA100 TACS-XL基本原位细胞凋亡试剂盒;TA200 TACS-XL DAB原位细胞凋亡试剂盒;TA300 TACS-XL蓝色标记原位细胞凋亡试剂盒;TA400 TACS-XL补充细胞凋亡试剂盒;

问:Caspase活性测试是如何使用的?

答:Caspase活性测试为在细胞裂解液中检测蛋白酶活性提供了简捷方便的手段。当对专一Caspase的多肽底物被裂解时,释放出的指示分子可用普通读光仪或荧光读板仪来做定量测定。将从细胞凋亡样本得到的信号同未经诱导的对照样本进行比较,可以确定Caspase活性增加的倍数,而Caspase酶活性是同检测到的信号直接成正比。

问:Caspase活性测试是否可用于定量检测?

答:R&D Systems的Caspase活性测定试剂盒可作为半定量测试。检测结果最好用于测量在细胞凋亡细胞中与未经诱导细胞中的Caspase活性倍数的增加。实验时,最好采用本底对照(无细胞裂解液或无底物的反应)。如果本底对照也有一定的读数,这一读数应当在记算倍数增加之前从试验数据中差减。

问:Caspase活性检测同Caspase ELISA试剂盒有何不同?

答:Caspase活性检测用于测定不同Caspase的蛋白酶的活性,表达为比未诱导样本的倍数增加。Caspase ELISA试剂盒用于测定不同Caspase在样本中的含量,以pg /mL定量表达。

问:caspase X 活性测试是对caspase X专一的吗?

答:大多数caspase会裂解所有的底物,它们根据Michaelis-Menton动力学趋于选择某一底物而非另一底物,但没有任何底物是对某一Caspase专一的。比如,Caspase 3和Caspase 7都可裂解DEVD底物;Caspase 9、4、5 都可裂解LEHD。R&D Systems为每一Caspase选择了它所适宜的底物。 如果反应进行的太久,一些Caspase会激活另一些Caspase。

问:Caspase活性检测试剂盒中的细胞裂解液是否同其它试剂盒中的一样?

答:所有的Caspase活性检测试剂盒中的细胞裂解液都是一样的。所以,可用它裂解细胞,和用于多种Caspase活性的测试。

问:R&D SystemsCaspase抑制剂是否可逆?

答:所有R&D Systems的Caspase抑制剂在N端有苯甲氧碳基(Z-)和FMK功能组,它们可穿孔细胞,是不可逆转的。

问:R&D Systems是否为Caspase活性检测提供阳性对照?

答:R&D Systems提供多种重组Caspase酶,它们是理想的阳性对照。如果试验者自己想建立一阳性对照,有许多可以产生细胞凋亡的阳性对照的方法都已发表。如果将细胞同2 mM星形孢菌素(Staurosporin)温育2小时,可诱导绝大多数细胞类型进入细胞凋亡。R&D Systems有文献资料列举了对Caspase如何产生阳性对照,可向我们的技术服务索取。


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