阶段 3:cDNA 的甲基化
材料
缓冲液和溶液
将贮存液稀释到合适浓度。
氯仿
10XEcoRⅠ 缓冲液
1XEcoRⅠ 甲基化酶缓冲液（选用)
如希望，可替代步骤 1 中的 Tris-HCl,NaCl 和 EDTA。
EDTA(0.5mol/L,pH8.0)
乙醇
MgCl2(1mol/L)
NaCl(5mol/L)
酚：氯仿
S-腺苷甲硫氨酸
用一级碘盐，预制含 5 mmol/L 硫酸和 10% 乙醇的贮存液（20 mmol/L）, 分装-20°C 保存。当购买 EcoRI 甲基化酶时，New England Biolabs 公司提供 S-腺苷甲硫氨酸溶液。
乙酸钠（3mol/L,pH5.2）
TE(PH8.0)
Tris-HCl(2mol/L,pH8.0)
酶和缓冲液
EcoRl
EcoRI 甲基化酶
New England Biolabs 公司销售的酶分离自带有可表达甲基化酶基因多拷贝质粒的大肠杆菌菌株。
凝胶
琼脂糖凝胶（1%)(见步骤 8)
核酸和寡核苷酸
双链 cDNA
使用按本方案阶段 2 步骤 14 所制备的 cDNA。
线性化质粒 DNA 或λ噬菌体 DNA
两者中任何一种可用来检査 EcoRⅠ 位点甲基化效率，线性化质粒在离其末端有一段距离处至少有一个 EcoRⅠ 位点。λ噬菌体 DNA 可像在琼脂糖凝胶电泳中用作分子质量标准物（如 HindⅢ消化的λDNA) 一样加以使用，对于质粒 DNA, 用 PstⅠ将 1ug DNA 完全消化，通过酚：氯仿柚提和乙醇沉淀纯化 DNA。DNA 溶于 5ul TE(pH7.6) 溶液，-20°C 保存。
专用设备
预设温度为 68°C 的水浴。
方法
1. 在 cDNA 样品（来自阶段 2, 步骤 14) 中加入以下试剂
2mol/L Tris-HCl(pH8.0) 5ul
5mol/L NaCl 2ul
0.5mol/L EDTA(pH8.0) 2ul
20 mmol/L S-腺苷甲硫氨酸 1ul
加 H2O 至 96ul
2. 取出两小份样品（各 2ul) 至 0.5 ml 微量离心管中，分别编为 1 号和 2 号，置于冰上。
3. 在余下的反应混合液中加人甲基化酶（80000 单位/ml), 保存在 0°C 直至步骤 4 完成。
4. 再从大体积的反应液中吸出另外两小份样品（各 2ul) 至 0.5 ml 微量离心管中，分别编为 3 号和 4 号。
5. 在所有四小份祥品中（来自步骤 2 和步骤 4) 加入 100ng 质粒 DNA 或 500ng 的λ噬菌体 DNA(按材料中所述方法制备）。这些未甲基化的 DNA 在预实验中用作底物以测定甲基化效率；
重要：在大体积反应中不要加入任何 DNA!
6. 所有四份小样实验反应和大体积的反应均在 37°C 温育 lh。
7. 于 68°C 加热 15 min，用酚：氯仿抽提大体积反应液一次，再用氯仿抽提一次。
8. 在大体积反应液中加入 0.1 倍体积的 3mol/L 乙酸钠（pH5.2) 和 2 倍体积的乙醇, 混匀后贮存于-20°C 直至获得小样反应结果。
9. 按下述方法分析 4 个小样对照反应：
a. 在每一对照反应中分别加入：
0.1mol/LMgCl2 2ul
10xEcoRⅠ缓冲液 2ul
加 H2O 至 20ul
b. 在 2 号和 4 号反应管中分别加入 20 单位 EcoRⅠ。
c. 四个对照样品于 37°C 温育1h, 通过 1% 琼脂糖凝胶电泳进行分析。
琼脂糖凝胶经溴化乙锭染色后，可见 cDNA 呈弥散的背景。甲基化的 DNA(管 3 和管 4 中的质粒 DNA 或λ噬菌体 DNA) 应对 EcoRⅠ降解有抗性，其大小不会改变；未甲基化的 cDNA 及管 1 和管 2 中的质粒或λ噬菌体 DNA 应该被 EcoRⅠ降解《如果确实_此，可继续进行第 10 步；否则须重复甲基化反应。
10.(接步骤 8) 微量离心机以最大速度离心 15 min(4°C) 以回收沉淀 cDNA。弃上清，加入 200ul70% 乙醇洗涤沉淀，重复离心。
11. 用手提式微型探测器检査是否所有放射性物质均被沉淀。小心吸出乙醇，在空气中晾干沉淀，然后将 DNA 溶于29ulTE(PH8.0)。
12. 尽可能快地进行 cDNA 合成的下一阶段。
阶段 4: 接头或衔接子的连接
材料
缓冲液和溶液
将贮存液稀释到合适浓度
ATP(10 mmol/L)
5XT4 噬菌体 DNA 聚合酶修复缓冲液
90 mmol/L(NH4)2SO4
0.33mol/LTris-HCl(pH8.3)
33 mmol/LMgCl2
50 mmol/Lβ-疏基乙醇
将缓冲液分装，贮存于-20°C。
溴酚兰（0.25%w/v,50% 甘油配制）
EDTA(0.5mol/L,pH8.0)
乙醇
酚：氯仿
乙酸钠（3mol/L,pH5.2)
TE(pH8.0)
Tris-HCl(1mol/L,pH8.0)
酶和缓冲液
T4 噬菌体 DNA 连接酶
T4 噬菌体 DNA 聚合酶
限制性内切核酸酶
取决于所用接头或衔接子的类型，如 EcoRI，NoeⅠ,SalⅠ或其他的限制性内切核酸酶
凝胶
琼脂糖凝胶（1%)
见步骤 12。
核酸和寡核苷酸
cDNA, 未甲基化的或甲基化的
使用在本方案阶段 2 步骤 14 或阶段 3 之歩驟 13 中制备的 cDNA。
对照 DNA
见步骤 10 提示。
dNTP 溶液，含有四种 dNTP, 每种浓度为 5 mmol/L
线性化质粒 DNA 或λ噬菌体 DNA
合成的接头或衔接子
专用设备
SephadexG-50 离心柱
将 SephadexG-50（中等大小孔径）加到无菌水中（10 g 干粉产生 160 ml 悬浆)。用无菌水淸洗膨胀的树脂数次以除去可溶的葡萄糖，否则在乙醇沉淀时由于沉淀可造成问题。最后用 TE（pH7.6) 溶液平衡树脂，高压消毒 [10psi(0.70 kg/cm3)15 min] 后室溫保存，預装好的 Sephadex 柱和其他凝胶过滤树脂有商品销售。
预设温度为 16°C 和 68°C 水浴。
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