基 本 方 案 1 塑 料 黏 附 和E A 玫 瑰 花结 富 集DC
此种技术用于分离DC已经使用了很多年，其间只经过了微小的修改（Steinman衫aZ.， 1979)
材 料（带V 项 目 见 附 录 1)
胶原酶消化的脾脏细胞悬液（见辅助方案）
高密度牛血清白蛋白（BSA) 溶液
R P M I 1640 培 养 基（如 Life Technologies) ， 4℃和 37°C
R P M I - 5 完全培养基， 4°C和 37°C
抗体偶联的绵羊红细胞（EA)
用于流式细胞分析的一抗（表 2. 3. 2)表 2.3.2 用来常规分析小鼠脾脏树突细胞的大鼠单克隆抗体
用 于 流 式 细 胞 分 析 的 二 抗（突 光 结 合 的 小 鼠 抗 大 鼠 I g G 和 I g M ; 如 BoehringerMannheim)
Beckman G H -3. 7 和 Sorvall HS-4 转子
15m l和 50m l聚丙烯锥底管
填充棉花和未填充棉花的高压灭菌的9in (约23c m ) 巴氏吸管，直 径 60m m 的组织培 养 皿（如 Falcon)
1 . 将胶原酶消化的脾脏细胞悬液于4°C ， 280 g 离 心 lOmin，弃上清。用 高 密 度 B S A 迅速重悬沉淀物，每个脾脏约lml。
2 . 准 备 B S A 柱 ：将 5 〜 6m l 细 胞 悬 液 加 入 15m l 离 心 管 中 ，在 悬 液 上 小 心 加 入 4°C 1.5m l 的 R P M I -1640培养基，形成一明显的界面。用 此 种 方 法 准 备 4 或 5 个 B S A柱 ，直至分完细胞悬液。
3 .将 B S A 柱 于 4°C ， 9500 g 离 心 15 min，缓慢加速，注 意 关 掉 「brake」开关。
4 . 小心地用填充棉花的巴氏吸管收集分界面的细胞，吸 走 全 部 的 R P M I -1640和顶部l m l B S A ，将细胞转移至另一干净的50m l 离 心 管 中（弃沉淀）。用 4°C 的 R P M I -1640充满离心管以稀释B S A ，缓慢摇动混匀。
5.于4°C ， 280 g 离 心 I O m m 后弃上清。重 悬 细 胞 于 5〜l O m l R P M I -5完全培养基后置于冰上。
6 . 台盼蓝染色计数活细胞（附 录 3C ，一个脾脏可得到IO7 个低密度的脾脏细胞）。
7 . 用 R P M I -5完 全 培 养 基 调 整 细 胞 密 度 至 大 约 IO7 个细胞/ml。每 4m l 悬液接种至60m m 培养皿内直至全部细胞铺板完毕。培 养 90miri使 D C 黏附。
8 . 弃非黏附细胞：用填充棉花的巴氏吸管吸取37°C R P M I -1640培养基，小心清洗培养皿表面，去除悬浮的细胞，直至培养皿表面由粗糙浑浊变为光滑并近乎清亮。重复洗涤一次。
9 . 每个培养皿加入4 ml 37°C R P M I -1640培养基并培养30〜60m i n 以去除黏附的淋巴细胞 。重复步骤8。
10.于倒置显微镜下利用相差观察培养皿。可见大部分深色星形树突细胞、一些明亮扁平的巨噬细胞，以及淋巴细胞、单核细胞之类的圆形细胞。如果树突细胞比例不高 ，则重复步骤8 、 9。
11.用 4m l 干净的R P M I -5完全培养基替换每个培养皿中的液体，培 养 12〜20 h 。
12.用填充棉花的巴氏吸管吸取37°C R P M I -5完全培养基洗涤平皿。将洗下来的细胞转移入置于冰上的15m l 离 心 管 中（每 管 可 装 3 个平皿的洗涤细胞）。用 2m l R P M I -5完全培养基洗涤平皿。重复该操作直到培养皿内的细胞收集完毕。
13.将收集的细胞于4°C ， 280 g 离 心 lOmin，弃上清。用 I m l 干 净 的 R P M I -5完全培养基重悬细胞后置于冰上。
14.台盼蓝染色计数活细胞（0.5X 106〜I.O X l O 6 个细胞/脾 脏 ，约 8 0 % 为 D C )。
15.按每个白细胞5 0 个 E A (抗体偶联的绵羊红细胞）的量加入E A (以 结 合 B 细胞和巨噬细胞），颠倒混勻。 4°C ， 70 g 离 心 lOmin。离心后不弃上清，直接将离心管置于冰上30 min。
16.吸弃部分培养基，剩 下 2〜2. 5 ml。用填充棉花的巴氏吸管轻微吹打细胞悬液10〜1 5 次以吹散大的团块但是不破坏玫瑰花结。
17.将重悬的细胞用血球计数器检查以确认是否每个玫瑰花结都是一个白细胞周围围绕着红细胞。如果有必要，再次悬浮细胞。
18.制 备 B S A 柱 ：将 5m l 高密度的B S A 加 入 至 15m l 的离心管中，小 心 地 将 2.5m l 玫瑰花结悬液加到液面上，从而形成一清晰的界面。
19•离心并收集细胞同步骤3〜6 (2X 105〜7 X 105 个细胞/脾脏 ，大 于 9 5 % 为 D C )。
20.用 表 2. 3. 2 中的抗体标记D C 用流式细胞仪检测其纯度。对于二抗，用荧光结合的小鼠抗大鼠Ig G 和 IgM 。
辅 助 方 案 胶 原 酶 消 化 制 备 脾 脏 细 胞 悬 液
用胶原酶消化的脾脏细胞悬液获得的D C 数量是用非消化法直接磨损脾脏获得的2〜3 倍（单 元 2.1)。这种方法也能够松解位于动脉周围鞘部位的D C 。
材 料（带V 项 目 见 附 录 1)
4000U /m l 胶 原 酶 D ，溶化后置于冰上
H B S S ，已灭菌，含 Ca2+ 、 M g 2+ (购置于 LifeTechnologies)
小鼠脾脏
皮下注射针， 22 G X l M i n 内 径（BectonDickinson)
10m l 、 5m l —次 性 注 射 器（如 Becton Dickinson)
IOOmm直 径 培 养 皿（如 Falcon)
2 个高压灭菌的锯齿状解剖镊（如 Roboz)
高压灭菌的不锈钢网.•将4 0 目的不锈钢网剪成5c m X 5c m 的小方格，向下折叠边缘 ，然后将四边弯成浅的矩形碗；锡箔纸包裹后高压灭菌。
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