1.将2 管 I m l 的 4000U /m l 胶 原 酶 D 稀 释（足够用于2 0 个脾脏）： Im l 加 入 9m l H B S S(稀 释 至 400U /m l ，步 骤 8 使用）， I m l 加 入 39m l 的 H B S S (稀 释 至 100U /ml)。置
于冰上。
2 . 将 22 G 针头连接在I O m l 的注射器上，充 满 l O O U / m l 的胶原酶。将 I O m l 的 l O O U / m l溶 液 加 人 I O O m m 的培养皿中。
3 . 取另外一个直径I O O m m 的培养皿进行操作。一只手拿镊子，另一只手拿注射器，拇
指放在活塞上。用 镊 子 夹 住 小 鼠 脾 脏 ，用 针 头 刺 入 脾 脏 被 膜 的 狭 窄 边 缘 ，注入100U /m l 胶 原 酶 100/xl。用镊子将脾脏推向针头，使针头前进几毫米。重复注射胶原酶 ，继续直到I m l 胶原酶都注射入脾脏，针头从另一端刺穿脾脏。
4 . 用针头撕开脾脏，将其转移至含胶原酶的培养皿中（步 骤 2)。重复操作，直到所有脾脏都注射和撕开。
5 . 从第二个培养皿中收集细胞悬液加入到置于冰上的50m l 离心管中。用 3m l l 00U/ml的胶原酶漂洗培养皿后加到上述50m l 离心管中。
6 . 加 入 3ml l 00U /m l 胶原酶至培养皿中。将撕碎的脾脏依次转移至培养皿。用 2 个镊子将它们撕成边长I m m 的小碎块，使其能通过5m l 吸管的内径。当所有的脾脏都撕碎 后 ，将先前放置脾脏碎块的培养皿中的胶原酶溶液加入进来，用 5m l 吸管猛烈吹打多次。
7 . 倾斜培养皿，将大块碎片除开，将细胞悬液转移至第5 步的置于冰上的50m l 离心管中。用几毫升lOOU/m l 的胶原酶洗涤培养皿后加入至离心管中。
8 . 在培养皿留下的脾脏碎块中加入IOml 400U /m l 的胶原酶。吹打数次后于培养箱里放置 30〜90 min。
9 . 在孵育的最后阶段，猛烈吹打碎片， 将其吸至直径I O O m m 培养皿的无菌钢网上。
10.用镊子固定钢网一端，用 几 毫 升 lOOU/m l 胶原酶洗涤碎块，然 后 用 无 菌 的 5m l 注射器活塞碾磨碎块。捣烂直到所有的红色物质从组织中去除。再用几毫升lOOU/ml胶原酶洗涤钢网。
11.将钢网从培养皿中拿开，丢弃无色的黏附的被膜碎块。猛烈的吹打培养皿中的液体 ，将其转移至步骤7 的 50m l 离心管里。用 几 毫 升 l O O U / m l 胶原酶洗涤培养皿后一同加入到离心管中（约 有 0 . 5 % 为树突细胞或者更少）。
12.如果需要，即可用高密度的B S A 离 心（见基本方案1)。
基 本 方 案 2 用 小 鼠 骨 髓 前 体 细 胞 培 养 树 突 细 胞（DC)
此 方 法（Inaba ， 1 9 9 2 ) 克 服 了 组 织 中 可 利 用 的 「内 源 性 A P C 」数量的有限性 。 一 旦培养成功，大量 的 D C 可用作细胞生物学的研究、遗传性状修饰、体内免疫。此种方法在研究D C 分化的生物学中也非常重要。
材 料（
6〜7 周 龄 小 鼠（最好为雄性鼠，因为它们的骨头比较粗大；运输后需要休息至少5天 ；不要使用应激或脱水的老鼠）
7 0 % 乙醇
冰冷的以及室温的R P M I -1640培 养 基（如 Life Technologies)
氯化铵溶液 〇• 02mol/L Tris • C U p H 7. 2 (附录I) /0•14mol/L N H 4Cl
裂 解 淋 巴 细 胞 的 抗 体（杂交瘤上清）（可选）。例 如 ，杂 交 瘤 R A 3-3A 1 (B 2 2 0 抗体 ； A T C C 号 TIB146)、 G K 1.5 (C D 4 抗 体 ； A T C C 号 Tffi 207)、 3.155
(C D 8 抗 体 ； A T C C 号 TIB211)、 M 5/114 ( M H C I I 抗 体 ； A T C C 号TIB1 2 0 ) —见 单 元 1. 3
兔 补 体（Pel-Freez)
R P M I -5完全培养基
小鼠G M - C S F (m G M -C S F ) : 可以来源于纯化的重组蛋白，也可来源于转染小鼠G M - C S F 基 因 的 细 胞 系 的 条 件 培 养 基（瑞 士 巴 塞 尔 A . Lanzavecchia博士赠送）
用 于 流 式 细 胞 检 测 D C 的 抗 体 ：如 M H C I I 类 分 子 的 杂 交 瘤 上 清（A T C C 号TIB120)、 B 7-2/C D 86 的 杂 交 瘤 上 清（Pharmingen)、 D E C -205 的 抗 体( A T C C 号 H B 290)
解剖用品
无菌纱布垫
I O O m m 培 养 皿（如 Falcon)
3 ml 注射器 25 G ， 5/8in (1.58c m ) 针头
9in (23c m ) 巴 氏 吸 管（填充棉花并高压灭菌）
Nytex 滤 器（3-40/26; Tetko)
15m l 和 50m l 聚丙烯锥底管
2 4 孔 培 养 板（如 Corning)
1 . 取小鼠股骨和胫骨，保存在置于冰上的R P M I -1640培养基中，直到所有的小鼠准备完毕。去除骨头上的肌肉（通常在无菌纱布垫上操作）后 ，将干净的骨头置于新的平皿里。然 后 在 含 7 0 % 乙醇的培养皿里浸泡骨头2 min，最 后 用 冷 R P M I -1640培养基 洗 涤 2 遍 。
2 . 用 剪 刀 减 去 骨 的 两 端（骺）然后将其转移到另外的培养皿中。用 注 射 器 吸 取 2 mlR P M I -1640培养基冲洗骨髓腔以获得骨髓。在另一培养皿里剁碎骨骺。将剁碎的骨骺以及从骨髓腔里冲洗出来的骨髓混合在一起，用吸管打碎团块，将悬液通过筛网(去除颗粒）后 收 于 15m l 或 者 50m l 的离心管里。
3.加入3〜I Oml 的氯化铵溶液裂解红细胞。室温静置3m i n 后 ，室温， 280 g离心IOmin(1200r/min Beckman G H -3. 7 转子），弃上清。
4 . 去 除 淋 巴 细 胞（可选）：将细胞配成I X l O 7 个细胞/m l ，加入合适浓度的杂交瘤上清(通常1 : 2 0 终浓度）和 兔 补 体（通 常 1 : 17〜1 : 2 0 终浓度）。 37°C 水浴培养lh，每
20m i n 振荡一次。
作者 用 了 B 220抗 体（杂交瘤R A 3-3A 1)、 C D 4 抗 体（杂 交 瘤 G K 1. 5)、 C D 8 抗体（杂交瘤3.155)和1MCHII抗 体（杂交瘤M5/114)。
5 . 用 R P M I -1640洗 涤 骨 髓 细 胞 2 次 ，室 温 ， 280 g 离 心 l O min。 计 数 活 细 胞（附录3 0 。 用 R P M I -5完全培养基调整细胞浓度至I X l O 6 个细胞/m l 。
6 . 加入小鼠重组G M -C S F 至终浓度为700〜lOOOU/m l 或 者 20ng/ml。将细胞悬液一般每只小鼠可以得到4 X 107〜5 X 107 个 骨 髓 细 胞（没有去除淋巴细胞）按 Iml/孔接种
2 4 孔板。
7.每两天洗涤细胞一次，每次移出旧的培养基，然 后 倾 斜 2 4 孔 板 用 R P M I -1640轻轻地沿孔壁洗涤细胞后吸出洗涤液，最 后 加 入 I m l 新 的 含 700〜lOOOU/ml (约 20ng/ml) m G M - C S F 的 R P M I -5完 全 培 养 基（步 骤 6)。
8.可选：验证聚集物的特征—M H C II类分子存在于不成熟 D C 的 胞 内 小 室（M H CII小室或者MIIC) 通 过 标 记 [3 H ] 胸腺嘧啶，可 发 现 1 0 % 〜2 0 % 的细胞处于S 期 ，用 流 式 细 胞 仪（单 元 4,1和单 元 4. 2 ) 分析，细胞中度表达膜M H C II类分子，但是
不 表 达 B 7-2/C D 8 6 共刺激分子。到 第 6 天 ， 培 养 板 孔 中 布 满 很 多 聚 集 体 或 者 球 形 的 处 于 增 殖 期 的 非 成 熟 D C 。
9.在 第 5〜8 天 期 间（此时已产生足够的聚集体），用 R P M I -1640或 R P M I -5培养基轻轻吹打，将聚集体从贴壁的基质细胞上脱离下来（此后几天一直会有聚集体产生）。收集脱离的细胞，室温， 280 g 离 心 lOmin，弃上清。用 R P M I -5培养基重悬，最高
浓 度 为 I X l O 6 个细胞/ml。然后铺在直径为I O O m m 的培养皿中，每 个 培 养 皿 10m l ，最 多 铺 I X l O7个细胞。
10.于细胞转移后24〜48 h 期间 ，每 24 h 轻轻摇晃培养皿，收集非贴壁、非增殖、成熟的 D C ，转移至另外的收集管中用于后期的研究。
11.计 数 活 细 胞（附 录 3 0 。用 流 式 细 胞 仪（单 元 4 . 1 和 单 元 4. 2 ) 或者用血球计数板(附录3C ) 计 数 大 的 形 状 不 规 则 的 细 胞 来 检 测 D C 得 率 （每 只 动 物 通 常 获 得 5 X IO6〜IOXlO6个细胞，> 6 0 % 表达成熟D C 的表面标志）。
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