2.3.2 第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
选用DYY-Ⅲ型（北京六一仪器厂生产）电泳槽（规格为200×200×1mm），分离胶浓度为12%，无浓缩胶。待胶聚合后，将电聚焦后已经平衡的胶条平放于浓缩胶顶端（避免胶条拉直），并用1%琼脂糖（电极缓冲液配制）封胶，特别应注意避免胶条与分离胶上沿产生气炮。61
厂板子之灌胶：坚决不用凡士林，用透明胶将两端（板子的2 边）封住，再用2%琼脂之SDS-PAGE
电极液封底，待琼脂凝固后再灌胶，最后用水封胶。over！
做之前，一定要保证，1，灌胶不会有任何问题，不能漏，2，不用浓缩胶，只用分离胶。3，分离胶用水封，要保证凝聚好的PAGE
胶，为一平的线，凹来凸去的就不要用了。玻璃版能用硅化剂最好不过了。防止从边上漏，我用透明胶（约4cm宽），封住两边，下面还是用2%的琼脂封。灌好电极缓冲液[25m
mol/LTris，192m mol/L
甘氨酸及0.1%SDS]，按25mA/板胶恒流进行电泳，待溴酚兰离底部1cm时即可停止电泳，一般电泳耗时约4-5h。银染：凝胶于40%甲醇，10%醋酸中固定1h以上或者过夜；用水洗1次，5min；30%乙醇洗2×20min；水洗6×5min；
0.02%硫代硫酸钠1min；水洗3×20s；0.2%硝酸银，0.02%甲醛快速的润洗一次，就是过一下的意思，到这个溶液进去，马上又倒掉；0.2%硝酸银，0.02%甲醛20min；水洗3×20s；显色液（3%碳酸钠，0.05%甲醛，0.0005%硫代硫酸钠）快速的润洗一次，就是过一下的意思，到这个溶液进去，马上又倒掉；显色液（3%碳酸钠，0.05%甲醛，0.0005%硫代硫酸钠）显色到你所希望的程度，自己看，背景好，点又多的话就可以了；水洗20秒；0.05%甘氨酸停显。染色理想温度：我去年4，5月时，通常染色都定在中午，12点多；温度最好是20
度左右，（这个温度我也没控制的）100%TCA领一瓶TCA 500g的那种 按分子克隆上的好象是直接加200多ml
水就成100%TCA了10%TCA，0.07%2-ME 丙酮 （100ml）：
100%TCA 10ml
2-ME 0.07ml
丙酮 90ml
0.07%2-ME 丙酮 （100ml）：
2-ME 0.07ml
丙酮 100ml
0 Farrel 液（9.5M Urea，2%NP-40，0.4%Am3.5~10，1.6%5~7，5% 2-ME）
50ml
Urea 28.5g
NP-40 1ml
Ampholine 5~7 2.0ml
3.5~10 0.5ml
2-ME 2.5ml
注意定容！配好后用1.5ml 管分装！-70度保存
注意 这两个溶液 配的时候 比如配 50ml 用100ml的烧杯 用量筒量50ml 水 倒如烧杯里面，用记号笔标上刻度，然后把水倒掉，再称 尿素 小量加水，因为尿素加水后体积会变大，再37 度水域锅里溶，然后加其它成分，最后再定到50ml
（2002-10-30 18：39：37）
UKS液 （含9.5M Urea，5mMK2CO3，1.25%SDS，0.5%DTT，2%Ampholine（3.5~10），6%Triton X-100）
25ml 50ml
Urea 14.25g 28.5g
K2CO3 17.25mg 34.5mg
SDS 0.3125g 0.625g
DTT 0.125g 0.25g
2-ME
Ampholine（3.5~10）1.25ml 2.5ml
Triton X-100 1.5ml 3ml（0.86ml 2 枪，4枪）
2-ME 可适当加一些！注意定容！配好后用1.5ml管分装！-70度保存！
双向电泳IPG（summer）
一、样品提取：三氯醋酸—丙酮沉淀法
（1）在液氮中研磨叶片
（2）加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1 小时）弃上清。
（3）加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。
（4）上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。
（5）用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用
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