小分子干扰RNA (Small interfering RNA ，siRNA )
是一种非常有效的工具，能够在包括哺乳动物细胞在内的多个体系中抑制特定基因的表达，从而研究某个基因的功能或者是相关信息。但是这种强有力的方法的难题之一是需要设计，合成siRNA
s 和验证其效果，从而找到最有效的siRNA s 。这个过程需要花费相当的时间和经费。以化学法合成基因特异的siRNA s
为例，由于设计好的siRNA s 中通常只有大约25% 的siRNA s 能高效抑制基因的表达（抑制效率>80%
），这使得化学合成siRNA 的成本升高。体外转录制备长片断RNA 并不难，但是由于研究表明长片断的双链RNA （>29bps
）在哺乳动物细胞中通常会引发抗病毒反应―― 一种非特异基因表达抑制，而目前体外转录往往无法制备小于29bp 的小分子siRNA s
。一个新的研究发现，用RNase III 降解长片断双链RNA 成为siRNA s
库也能够有效诱导特异的基因沉默，这样可以避免了筛选有效siRNA s 的漫长过程，从而快速，经济的实现特定基因表达的沉默。
在线虫、果蝇和其他一些物种的RNA 干扰(RNA interference ，RNA i) 通路中，长片断的双链RNA
进入细胞后会被一个类似RNase III 的内切核糖核酸酶(Dicer) 降解为一系列的21―23bp
长度，3’端有两个碱基突出（带羟基）5’磷酸化的siRNA s 。这些siRNA s 介导同源转录本的降解，从而导致基因表达沉默。( 1-5)
大肠杆菌Escherichia coli RNase III 参与多种细菌RNA s，噬菌体甚至是质粒来源的RNA s 降解(6-9)
，能够将长片断的双链RNA s降解为一系列12―15bp 的短双链RNA s，产物末端结构类似Dicer 降解产物(9) ，通过改变RNA
seIII
的酶切条件可以提高降解产物的平均长度，达到目前的21bp。这些21bp的降解产物能够有效介导在哺乳动物细胞和小鼠胚胎中特定基因的RNA
i(10,11) 。另外，实验表明，RNase III
的完全降解产物（12―15bp）同样可以诱导专一的基因沉默，效果与化学合成或者是酶法得到的siRNA s 相当。
验证RNaseIII 的消化能力
采用RNaseIII 分别消化体外转录制备的人源GAPDH ，La 和c-FOS(200 bp) 双链RNA ，从而验证RNaseIII
的消化能力，结果表明，1个单位的RnaseIII 在37度1小时可以将1mg 的双链RNA 降解为30bp以下，主要是12―15bp
的siRNA s 混合物。用其他基因的双链RNA ，同样证实RNaseIII 能够消化各种双链RNA 序列。另外用Cyclophillin,
c-myc, Map Kinase 9, PKC-alpha, Raf-1, Nautilus, 和 h-ras 等基因的双链RNA 作为
RNase III 底物，也可以得到同样的结果。这表明 RNase III 能够消化各种来源的双链RNA 。
验证 RNaseIII 降解产物诱导基因沉默的能力
GAPDH 和La 在Hela细胞中的丰度高，也比较容易检测内源基因的表达水平。将RNaseIII降解GAPDH 和La 得到的siRNA s
库转入Hela 细胞，用免疫荧光法检测其诱导基因沉默的能力。根据所检测的细胞数量对荧光信号进行平衡化和定量。但是内源的c-FOS
在293细胞中的丰度较低，表达水平下调后就难以检测，为了做同样的验证，实验采用50nM 佛波脂 phorbol ester (PMA)
提前24小时诱导处理使c-FOS 表达水平升高。用由RNase III 消化c-FOS 双链RNA 得到的siRNA s
混合物转染293细胞，用同样方法检测对基因表达的抑制效果。结果显示用RNase III 消化各种双链RNA 得到的siRNA
库对相应的基因表达抑制效果分别是：GAPDH 表达水平下调78% ，La 表达水平下调86% ，而c-FOS 表达水平则下调75%
。这个结果表明RNase III 得到的siRNA s 库能够非常有效的抑制基因的表达。
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