【实验试剂与器材】
(1)Oligo(dT)纤维素
(2)层析柱装置
(3)1×上样缓冲液:20mM Tris.Cl (pH7.6),0.5M NaCl,1 mM EDTA.Na2 (pH8.0),0.1%十二烷基肌氨酸钠(SLS)
配制方法:
用Tris.HCl、NaCl和EDTA母液,加入各成分确切含量后,15磅高压15分钟,待溶液冷却至65℃时,加入预先在65℃水浴30min的
10% SLS,至终浓度为0.1%。也可用0.05M柠檬酸钠代替Tris.HCl。然后用0.1%DEPC处理整个缓冲液。
(4)洗脱缓冲液: 10 mM Tris.HCl (pH7.6),1 mM EDTA.Na2 (pH8.0),0.05% SDS
先将Tris.HCl和EDTA混合后高压,然后加10%SDS至所需浓度,此缓冲液配制后不可高压。
(5)3M NaAc (pH5.2)
(6)DEPC (焦碳酸二乙酯,sodium acid pyrophophate)处理水:0.1% DEPC双蒸水,37℃摇动温育至少12h,然后15磅高压15min。
【实验方法与步骤】
(1)将0.5~1g的Oligo(dT)纤维素悬于0.1M NaCl溶液中,然后用0.5~1ml装柱;用3倍柱容积的DEPC-H2O洗柱,再用1×上样缓冲液洗柱,至洗出液pH<8.0;
(2)将RNA溶液在65℃加热5min,然后迅速冷却至室温,加入等体积的2× 上样缓冲液,混合后直接上样,并收集流出液。重复此过程2-3次以使mRNA更充分地结合到纤维素上;
(3)用2~3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱mRNA;
(4)加入1/10容积的3M NaAc (pH5.2)于mRNA洗脱液中,混合后加入2.5倍体积的冰冷无水乙醇,混匀后-20℃沉淀30min;
(5)10000×g,4℃离心15min,弃上清。用70%乙醇漂洗,10000×g离心5min,弃上清,室温蒸发乙醇;
(6)用适量的无RNase污染的水溶解mRNA。此mRNA可用于 Northern印迹,RT-PCR及核酸保护试验。若长期保存,可加入3倍体积的无水乙醇,置-70℃。
【注意事项】
(1)因为RNA易被RNase降解;整个操作不能有RNase的污染,同时要注意无菌操作。
(2)所有试剂的配制均用DEPC处理过的水
(3)加入3倍体积的100%乙醇于RNA溶液中,-70℃可长期保存.
(4)此RNA可用于第一股cDNA的合成,Northern印迹,核酸酶保护试验等。
三、质粒DNA的制备
【实验目的】
熟悉质粒DNA常用的制备方法
【实验原理】
转化细胞中的质粒DNA制备主要包括三个步骤:细菌的培养、收获和裂解、质粒的分离和纯化。低浓度的碱和SDS可以有效地裂解细菌的细胞壁,从而使质粒释放出来。
【实验试剂与器材】
1.细胞悬浮液: 50mM葡萄糖,25mM Tris.Cl,( pH8.0),10mM EDTA.Na2,(pH8.0)
2.细菌裂解液: 0.2mol/L NaOH,1% SDS
3.中和液: 60ml 5M醋酸钾,11.5ml 冰醋酸,28.5ml双蒸水
4.3mol/L NaAc (pH 5.2)
5.TE饱和酚 (pH8.0)
6.氯仿/异戊醇 = 24:1
7.RNase(20mg/ml)
【实验方法与步骤】
(一)质粒的小量制备:
1.将5ml LB培养液(含筛选抗生素)加入到容量为15ml并通气良好的试管中,然后将转化菌的一个单菌落接种于培养液中,37℃以225rpm速度振荡培养 14-16h;
2.10,000rpm,4℃离心5min,弃培养液;
3.用预冷的细胞悬浮液将菌体悬浮起来,室温放置5min;
4.加入细菌裂解液,上下颠倒微量离心管以裂解细菌,待溶液变黏稠为止;
5.加入中和液,上下颠倒混合后置冰上5min,12,000rpm,4℃离心5min;
6.将上清移至另一离心管中(注意不要混入白色沉淀物),加入等体积的TE饱和酚/ 氯仿(1:1)混合液,振荡混匀1min,12,000rpm离心2min;
7.将上层水相移至另一离心管中,加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)溶液,振荡混匀1min,12,000rpm离心2min;
8.将上层水相移至另一离心管中,加入2.5倍体积的无水乙醇,置-20℃沉淀15-30min,然后12,000 rpm离心15min;
9.弃上清,于沉淀中加入100?滋L双蒸水或TE(pH8.0)溶解沉淀,加入20?滋g/ml
RNase,置室温30min,然后加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1),振荡混匀1min,12,000rpm离心2min,将上层水相移至另一离心管中,加入0.1倍体积3M
NaAc(pH5.2)和2.5倍体积无水乙醇,置-20℃沉淀15~30min,然后离心15min;
10.弃上清,加入70%乙醇( 注意不要混合),12000rpm离心10min;
11.弃上清,真空干燥或自然干燥质粒DNA;
12.用去离子水溶解质粒DNA,-20℃保存备用。