新型冠状病毒在国内虽然基本已经得到较好的控制，但是疫苗的研发还处在攻坚阶段。今天我们解析的这篇文章是来自于《Molecular
Therapy》(IF=6.9) original aticle. 这篇文章中采用日本BEX CUY21 EDIT
II活体/细胞电转化仪，对BALB/c小鼠进行DNA疫苗电转注射，发现和mRNA疫苗相比，sa-RNA是更好的抗病毒疫苗。
摘要
目前，某些病原体扩散迅速且变异率高，但疫苗的研发与生产有时候跟不上速度，不能更快更准的控制病原体的侵袭与扩散，随之带来的严重后果不敢想象。因此，迫切需要发现新的疫苗种类去缓解这状况。RNA疫苗一直倍受欢迎, 源于其安全，生产无需细胞，可以快速对病原体产生免疫反应。
目前有两种RNA疫苗种类：
1． 合成mRNA，其仅编码目标抗原。
2． 自扩增RNA（sa-RNA），是病毒衍生的RNA，编码目标抗原和使RNA疫苗复制的蛋白质。
目前为止的研究表明：两种疫苗类型均可诱导免疫反应，但并未明确哪种方法是最佳的。因此，本研究比较了一下合成mRNA和sa-RNA表达的流感病病毒血凝素。发现两种RNA都有保护性。但同等的保护水平，sa-RNA 仅需要1.25 mg，而mRNA 需要80 mg，足足节省了64倍的原料。确定sa-RNA比mRNA更有效后，又以sa-RNA作为疫苗测试了三株流感病毒，分别为H1N1，H3N2（X31）和B（马萨诸塞州）毒株，并且发现sa-RNA都能保护目标免受感染。当sa-RNA制成三价制剂，可以防止H1N1和H3N2病毒侵染。由此我们得出结论：sa-RNA更具美好前景的抗病毒疫苗。
背景介绍
流感病毒是一种具有大流行潜力的病原体，属于正粘病毒科，可分为3种型：A，B和C型流感。由于它们的RNA基因组是分段的，因此有许多亚型，尤其是在A型流感病毒中。发生不同病毒亚型的突变和重组相当容易导致新菌株的频繁出现。在人类中，流感病毒在20世纪引起了3次大流行。2009年最新的“猪流感”大流行被认为是低致病性毒株，但仍然感染了约2亿人，并造成了201,200人死亡。目前，大多数流感疫苗是由灭活疫苗制备的病毒，生长在有胚的鸡蛋中，但这对于禽类病毒，可能对鸡胚有高致病性。从这方面来说，RNA疫苗更有效率。mRNA已用于免疫小鼠，雪貂和猪，获得其流感疫苗。2013年，sa-RNA已用于防治H1N1和新兴的H7N9亚型流感病毒。
因为病原体序列数据采集的速度较快，所以核酸疫苗是较有前景的疫苗种类。此外，与灭活或减毒病毒相比，核酸是不变的基本产物，所需的监管测试更少。目前已经提出了两种核酸疫苗种类用于疫苗接种，即RNA和DNA。相对来说，RNA是较好的，因为与DNA疫苗（必须克服两个转录障碍，即细胞膜和核膜）不同，RNA疫苗一旦进入细胞质就可以将其转化为抗原，这不但提高了转染效率，而且使免疫应答具有连锁反应。RNA疫苗快速与安全，生产过程无需细胞，且能诱导B细胞和T细胞反应，优点明显。虽然合成mRNA可立即翻译抗原，有良好的抗病毒保护作用，但其合成需要大量的mRNA原料。从小型动物所需的材料扩大到人类，可能会在出现流行病时限制疫苗的使用。因此，需要对该方法进行进一步的研究。
BEX CUY21 EDIT II在此研究中的作用
最新款的CUY21 EDIT II 采用最先进的脉冲芯片控制技术，BEX独有的多步脉冲，反向脉冲及恒流脉冲转化模式，无需任何专用试剂，提供高效高存活率的转化。
本研究中，为了验证DNA疫苗是否可预防H1N1流感，所以对BALB/c小鼠进行DNA疫苗电转注射，采用150v穿孔电压，5个正负交替极性脉冲。
结果
1.少剂量的sa-RNA即可与mRNA等效。
A/B：用120，80，20ug H1N1/PR8 HA-mRNA 及5ug灭活病毒（def-Virus）和乳酸林格缓冲液对BALB/c小鼠进行肌肉注射，三周后再进行一次增强免疫。然后通过HAI（A）和VNT（B）对其体内H1N1特异性抗体进行检测。
C/D：BALB/c小鼠通过鼻内感染10倍剂量的H1N1/PR8 HA-mRNA，其生存率（C）与体重变化（D）。
E/F：用1.25，0.25，0.05ug H1N1/PR8 HA-SaRNA 及5ug灭活病毒（def-Virus）和乳酸林格缓冲液对BALB/c小鼠进行肌肉注射，三周后再进行一次增强。然后通过HAI（E）和VNT（F）对其体内H1N1特异性抗体进行检测。
G/H：BALB/c小鼠通过鼻内感染10倍剂量的H1N1/PR8 HA-SaRNA，其生存率（C）与体重变化（D）。
2.Sa-RNA与mRNA应答反应的对比
3.与mRNA相比，sa-RNA可以表达更多抗原。
A：BALB/c小鼠通过肌肉注射4ug（每条腿2ug）带有萤光素酶基因的Sa-RNA和mRNA。在接种后的各个时间点进行腹膜内注射D-荧光素，使用IVIS光谱体内成像系统观察表达情况。每个时间点选择一张代表性图像。
B：来自n = 6只动物的荧光素酶水平情况，点代表平均值±SEM。
4.sa-RNA的效率可以通过改变其运输方式进而提升，如聚乙烯亚胺运输方式（PEI-based）。
A/B：BALB-c小鼠分别用PEI-Sa RNA和仅Sa-RNA在第一天与第21天注射。在第19天（A）与54天（B）收集血清。
5.编码A型流感病毒的sa-RNA疫苗可预防目前的季节性流感毒株。
A-F：BALB-c小鼠肌肉注射1.5ug和0.5ug Cal‘09 H1N1 HA-Sa RNA。
G-I：BALB-c小鼠肌肉注射1.5ug和0.5ug B-Mass H1N1 HA-Sa RNA。
J-L：BALB-c小鼠肌肉注射1.5ug和0.5ug X31 H3N2 H1N1 HA-Sa RNA。免疫应答反应结果与1.5ug HIV Sa-RNA（阴性对照），蛋白质疫苗和无进行免疫的小鼠作对比。
A：接种疫苗后测量H1N1特异性IgG。
B：小鼠鼻内感染了Cal’09 H1N1病毒后的体重变化。
C：测量肺中H1N1 流感M基因拷贝数。
D/E：H1N1特异性IgG与特异性IgG2a/IgG1的测量情况。
F：肺中特异性H1 CD8+T细胞在感染后第7天的测量情况。
G：对于B-Mass，特异性IgG用ELISA方法检测。
H：小鼠鼻内感染了B/Florida/06病毒后的体重变化。
I：流感病毒B NS基因肺中的拷贝数测量情况。
J：H3N2特异性Ig ELISA测量情况。
K：小鼠鼻内感染了X31 H3N2病毒后的体重变化。
L：测量肺中流感X31 H3N2 M基因拷贝数。
6.与单一HA相比，结合三种HA的sa-RNA（三价Sa-RNA）不会降低对H1NI 和H3N2的抵抗作用。
A-C：BALB/c小鼠肌肉分别注射1.5ug Cal’09 H1N1，B-Mass和X31 H3N2 Sa-RNA（三价Sa-RNA），仅1.5ug Cal’09 H1N1和1.8ug流感病毒蛋白疫苗，三周后进行一次增强免疫。
A：特异性H1N1 IgG抗体的ELISA检测情况。
B：特异性H3N2 IgG抗体的ELISA检测情况。
C：特异性B IgG抗体的ELISA检测情况。
D：在第7周，小鼠感染Cal’09 H1N1流感病毒，并且每天监测体重变化结果。
E：7天后，三价Sa-RNA实验组与仅Cal’09 H1N1实验组感染X31 H3N2流感病毒后体重变化结果。
7.单剂量的sa-RNA或DNA疫苗可预防H1N1流感
A：BALB/c小鼠肌肉注射1.5ug Cal’09 H1N1 DNA或Sa-RNA疫苗。RNA注射是带运输方式的形式，DNA注射是带运输方式的形式或仅DNA形式，通过肌肉电转注射。4周后，感染Cal‘09 H1N1流感病毒，对其体重情况进行测量。
B：感染后7天，测量肺中M基因拷贝数。
C：感染后4天，特异性H1N1 IgG 测量。
D：特异性IgG2a/IgG1的测量情况。
E：感染后7天，通过五聚体染色法在肺组织中测量流感病毒特异性CD8 + T细胞的比例。
结论
本研究比较合成mRNA和sa-RNA表达的流感病病毒血凝素。发现两种RNA都有保护性的。但同等的保护水平，sa-RNA 仅需要1.25 mg，而mRNA 需要80 mg，足足节省了64倍的原料。确定sa-RNA比mRNA更有效后，本实验以sa-RNA作为疫苗测试了三株流感病毒，分别为H1N1，H3N2（X31）和B（马萨诸塞州）毒株，并且发现sa-RNA都能保护目标免受感染。当sa-RNA制成三价制剂，可以防止H1N1和H3N2病毒侵染。由此我们得出结论：sa-RNA是有美好前景的抗病毒疫苗。
参考文献
PMID: 29275847
PMCID: PMC5835025
DOI: 10.1016/j.ymthe.2017.11.017
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