正确使用和保养色谱柱,将对色谱柱的分离效果、寿命起到关键作用,“KNAUER色谱学堂”将陆续推出色谱柱的使用、保养的知识。
不同规格色谱柱的平衡时间
一般色谱柱的平衡时间取决于色谱柱的尺寸,通常在进入10-20倍柱体积,基线达到平稳后,柱子可达到平衡。 在下表总结了不同尺寸的色谱柱的平衡时间。
规格 | 柱体积(ml) | 流速(ml/min) | 平衡时间(min) |
250*4.6mm | 2.91 | 1.0 | 58 |
150*4.6mm | 1.74 | 1.0 | 35 |
100*4.6mm | 1.16 | 1.0 | 23 |
50*4.6mm | 0.58 | 1.0 | 12 |
250*4.0mm | 2.20 | 1.0 | 44 |
125*4.0mm | 1.10 | 1.0 | 22 |
250*2.0mm | 0.55 | 0.25 | 44 |
150*2.0mm | 0.33 | 0.25 | 26 |
50*2.0mm | 0.11 | 0.25 | 9 |
色谱柱对流动相pH的耐受性
一般的硅胶基质的HPLC色谱柱在pH 2-8内是稳定的。随着科技的发展,现在也有些改性色谱柱pH耐受范围也变得更加宽(例如:KNAUER Eurospher II C18H和C18P两款色谱柱pH耐受范围:1-12)。
超纯硅胶的固定相也可以在pH高达11条件下使用(KNAUER Eurospher II采用第三代超纯球形硅胶),也取决于流动相pH调节剂的化学性质。比如弱碱(例如氨类),部分强碱(例如四氢吡咯)不会侵蚀硅胶的表面,因此可以作为流动相pH调节剂。不建议使用强碱。
正相柱的使用范围
正相柱不仅可以在正相系统中使用,而且部分正相色谱柱也可以在反相系统中使用,比如氨基柱(正相色谱柱中最灵活的色谱柱),它可应用于正相、反相、离子交换(弱阴离子交换柱)中,在反相色谱柱中主要用于碳水化合物的分析;氰基色谱柱也可用于正相和反相(碳水化合物、甾体、极性化合物)分析。
注意:氨基柱正相模式转反相模式时,请使用异丙醇小流速过夜冲洗色谱柱。流速建议0.1-0.2mL/min,之后再转换到100%乙腈冲洗20柱体积,然后转换到和流动相相同比例的不含盐的乙腈水体系(水相不超过40%)冲洗20柱体积。
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