交联质谱技术采用化学交联剂处理蛋白质样品,将空间距离足够接近、可以与交联剂反应的两个氨基酸以共价键连接起来,酶切后利用质谱技术分析交联产物。交联蛋白质在不同位置发生酶切,可以产生三种交联产物:1)肽段间交联;2)单链肽段内部交联;3)被交联剂单侧修饰的单链肽(图1)。这些交联的肽段丰度偏低、信号差,容易受到高丰度的非交联肽段的掩盖,给交联谱图鉴定带来困难。为了提高交联肽段的鉴定量,常采用可富集的交联试剂,通过亲和纯化富集交联肽段,然后采用液质联用进行鉴定,排除非交联肽段的干扰。然而即使采用非常有效的可富集的交联试剂,如PhoX,交联肽和被交联剂单侧修饰的单链肽会被共同富集,丰度较高的单链肽阻碍了交联肽的有效鉴定。
图1. 化学交联产物的类型(肽段间交联、肽段内交联、单侧修饰的单肽段)
交联肽段的分布集中于 500Å2、2000Da 以上的区域,针对这些特征,推出了 caps-PASEF 扫描模式,重新设定了母离子 CCS、m/z 扫描区域。这种新型的 caps-PASEF 扫描模式,不仅可以屏蔽单电荷杂离子的干扰,还能减少 50 - 70% 针对单侧连接肽段的扫描,使质谱分析更集中于交联肽段(图3)。
图3. caps-PASEF扫描模式用于交联肽段的分离和鉴定。A. 母离子的淌度碰撞截面积CCS和m/z分布图;B. 母离子的淌度碰撞截面积CCS和m分布图,红色虚框里是母子扫描区域;C. 选择框内、外,交联肽段、单侧连接肽段的母离子数目统计;D. 选择框内的母离子CCS和m分布图;E. caps-PASEF和经典PASEF扫描模式下,交联肽段、单侧连接肽段的母离子数目统计。(红色为交联肽段;蓝色为单侧修饰肽段;灰色为其他母离子)
对于简单蛋白质、蛋白质混合物以及高度复杂裂解产物的检测时,这种 caps-PASEF 扫描模式可显著增加交联肽段的鉴定量。目前,相关的 4D-ProteomicsTM 交联质谱的数据分析、统计学方法仍在开发中。随着布鲁克和合作团队对样本处理、采集模式、分析算法的不断开发,4D-ProteomicsTM 交联质谱必将越来越完善,在蛋白质结构与相互作用领域展现出更加广泛的应用前景。
参考文献
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