H-Class系统不出峰影响因素比较多,故障排除时先检查简单的部分,然后再进行仪器硬件排查。
检测内容
方法
必须仔细检查仪器方法。仪器方法变更条件时,由于名称相同而会被覆盖,必须仔细查看方法里的参数是否正确,例如:波长、流动相、柱温等。检测器采样速率设置是否合理也会影响出峰,若是UPLC 1.7 µm柱,峰型应该比较窄,故检测器采样速率建议设置为20点,待有目标峰后再适当调整。
确认该测试方法原来测试过,则比较二者方法间的差异及测试运行参数(如压力/能量等);该测试方法若过去没有测试过,请先测试另外一个已测试过的样品(最简单的是运行柱效测试或性能测试),以验证仪器系统是否正常,而对没有出峰的测试方法再核查方法来源的可操作性。
样品
样品是否出错,样品是否已变质或分解,样品瓶位是否放错,样品量是否足够,溶解样品的溶剂是否变化。
流动组
流动相是否正确,是否放错流路,如原来放A路,现在放到B路,但在软件里没做相应的修改。流动相是否变质,水和缓冲盐容易长菌,建议现配现用,每天更换。流动相里的有机相是否已挥发,溶剂瓶要用合适的瓶盖盖好。
柱子
柱子的颗粒度、内径、长度和品牌是否正确,柱子是否被污染,是否有预柱。
仪器硬件排查
检查H-Class系统的色谱柱前、柱后,直至连接检测器的管路接头等是否有漏液。
观察系统压力,如果压力低或压力波动,建议在UPLC的Console界面进行QSM的Prime,并检查溶剂过滤头,单向阀,泵杆和密封圈。
充分灌注进样器SM FTN的注射器(建议Purge Solvent做20个cycles)并注意观察,保证注射器里充满Purge Solvent且没有任何气泡或漏液。另外,可以用称重法进一步检查进样器是否有问题,用样品瓶装1 ml左右的水,先称重量,然后进20针10 µl水后再称重,使用100 μl注射器,减重理论值应在196~204 mg之间,如果重量没有变化,说明样品没吸进去。
检测器有问题也会导致不出峰。以最常用的TUV为例,TUV在流通池充满甲醇的状态下查看230 nm波长的能量,正常情况下,Sample能量应该是Reference 能量的70%以上,如果小于70%,说明流通池污染了。建议接两通,用水、甲醇等充分冲洗。如果Reference能量本身很低,则需更换灯或光路系统其它配件。
TUV检测器查看能量
性能测试
用Startup Solution来检查仪器系统是否正常,H-Class不同检测器进行性能测试所用的试剂如下:测试结果判断
(以TUV/PDA检测器10 mm流通池为例)
峰面积及保留时间的确认
进样六针咖啡因,峰面积RSD≤0.5%,峰高RSD≤1.1%,保留时间SD≤1.0s
梯度性能测试(A/C水,B/D乙腈)
进样三针保留时间的SD≤1.5s
根据上述的故障排查步骤,可以快速找到H-Class系统不出峰的原因,然后再采取相应措施,让检测状态尽快恢复到正常水平。
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