N-糖谱图在生物制药过程中通常被定义为关键的质量属性，因为它是衡量疗效、安全性以及生产条件的一个指标。因此临床和商业化生物治疗制剂的蛋白糖基分析方法是否具有高灵敏度和详尽表征的能力无疑非常重要。除此之外，如果分析方法还能够以快速的运行时间和高通量加快产品开发进程，其优势将更加明显。
长久以来，人们不断地对传统的N-糖样品制备方法进行改进，但是迄今为止还没有找到一种集简单、高MS灵敏度以及高通量于一身的解决方案。因此人们研究了能在数分钟内生成标记蛋白糖基的快速标记方法。
实验
在快速反应中，使用连接脲的氨基苯甲酰胺对前体糖胺的还原性醛端进行修饰。虽然这种快速标记试剂能够加快标记过程，但是它无法提供现代N-糖分析所需的更高的电离化效率。
为了解决上述问题，我们开发了一种样品制备解决方案，该方案能够为蛋白糖基检测提供前所未有的FLR和MS灵敏度，同时还能提高N-糖样品制备的通量。为了进一步加快N-糖的制备过程，我们还将快速标记步骤直接与使用了RapiGest™ SF表面活性剂的快速PNGase F糖基游离步骤集成，并且还包括HILIC μElution SPE纯化步骤。
结果与讨论
合理设计的新型N-糖标记试剂
我们基于合理设计的考虑合成了一种可以协助进行N-糖分析的新型标记试剂，该试剂能够实现快速标记动力学和高荧光量子产率，而且可显著提高MS检测能力。我们新设计的标记试剂放弃了还原胺化，转而利用水相快速标记反应。为此，沃特世利用其在氨基酸快速荧光标记方面的丰富经验开发了一种能够满足现代N-糖分析需求的新型试剂。二十多年前，沃特世推出了一种被称为AccQ•Fluor™ 的快速标记试剂，这种试剂现在已经被广泛用于通过荧光检测准确分析蛋白质样品的氨基酸组成。
RapiFluor-MS的分子结构，图中突出显示了能够实现快速标记、高效荧光以及增强的电离效率的化学结构。
AccQ•Fluor具有两个重要的化学特征：NHS-氨基甲酸酯快速标记反应基团和高效的喹啉荧光基团。AccQ•Fluor的这些结构构成了新型蛋白糖基标记试剂的基础。除了快速标记的能力外，新型标记试剂还能提供极高的MS和荧光检测灵敏度。这一新型试剂与AccQ•Fluor的不同之处在于它还具有叔胺侧链，这一结构的作用是增强正离子电喷雾电离(ESI+)的MS信号。总而言之，这一新型N-糖标记试剂建立在沃特世丰富的化学试剂专业知识基础之上，具有三种重要的化学结构：快速标记反应基团、高效荧光基团以及强碱性MS活性基团。为了体现出这些出色的属性，这一新型标记试剂被命名为RapiFluor-MS™。
根据实验室不同的样品前处理需求，Waters® GlycoWorks RapiFluor-MS N-糖分析试剂盒目前提供有24个样品和96个样品两种规格可供选择。RapiFluor-MS标记试剂可将MS灵敏度提高至现有方法的100~1,000倍。它还支持一套简单、稳定的方案，适用于配备有ACQUITY® QDa®质谱检测器的常规实验室。
RapiFluor-MS可实现高灵敏度检测
我们对RapiFluor-MS的N-糖标记进行了深入研究，特别对比了使用RapiFluor-MS标记的蛋白糖基与使用其它试剂标记的蛋白糖基的响应因子。下图展示了源自小鼠单克隆抗体并分别用RapiFluor-MS和Instant AB标记的等量N-糖的HILC荧光和基峰强度(BPI)MS谱图。根据观测到的色谱峰面积，得到了IgG谱图中含量最高的蛋白糖基 — 岩藻糖基化双天线FA2蛋白糖基的荧光及MS检测响应因子。FA2蛋白糖基的结果表明，RapiFluor-MS标记的蛋白糖基的荧光信号比Instant AB 标记的N-糖的荧光信号高2倍，更惊人的是，它的MS信号比后者高780倍。
RapiFluor-MS(A)和Instant AB(B)标记的、来自完整单克隆抗体质量数检测标准品的N-糖的HILIC-FLR-MS谱图。荧光(FLR)色谱图以橙色表示，基峰强度(BPI)MS谱图用蓝色表示荧光(FLR)和MS(基峰强度)的响应因子分别用橙色和蓝色表示。重复进行两次分析。
我们通过类似的方法将RapiFluor-MS标记与传统的2-AB标记进行了对比。为了进行对比，分别使用RapiFluor-MS和2-AB标记了源自混合人源IgG的N-糖，并以相同的进样量对其进行了HILC-FLR-MS分析。我们再次发现使用RapiFluor-MS标记的蛋白糖基的检测信号明显更高(比2-AB标记的蛋白糖基的荧光信号高14倍，比其MS信号高160倍)。
RapiFluor-MS(A)和2-AB(B)标记的、来自混合人源IgG的N-糖的HILIC-FLR-MS谱图。
为了汇总上述观察结果，我们以Instant AB和2-AB的响应因子占RapiFluor-MS响应因子的百分比作图。从下图中可以看出，荧光和MS灵敏度方面的增长是非常明显的。该图中还给出了使用另一种标记试剂(普鲁卡因胺)进行还原性胺化反应的相对性能。与普鲁卡因胺相比，RapiFluor-MS在MS在灵敏度方面有相当大的提高。也就是说，新型RapiFluor-MS标记试剂不仅支持蛋白糖基的快速标记，而且还可为分析人员提供无与伦比的荧光及MS检测灵敏度。
蛋白糖基标记的相对性能
使用新型Rapid PNGase F和RapiGest SF表面活性剂进行快速糖基释放
RapiFluor-MS标记对N-糖样品制备产生了革命性的影响，它能够和GlycoWorks RapiFluor-MS N-糖试剂盒一起被实验室轻松采用。优化的N-糖样品制备工作流程仅需三步：糖基释放、标记以及纯化步骤。为了确保RapiFluor-MS快速标记不受耗时的糖基释放过程影响，沃特世与纽英伦生物技术公司合作，共同开发了专为集成快速标记试剂而设计的Rapid PNGase F糖基释放方案。
使用RapiFluor-MS N-糖试剂盒快速制备N-糖的工作流程
稳定的定量HILIC SPE
如前文所述，N-糖样品制备的最后一步旨在提取出标记的蛋白糖基以备分析。因此，我们设计了一种使用固相萃取法(SPE)从反应副产物中提取已标记蛋白糖基的有效方法。GlycoWorks™ SPE吸附剂具有强极性，能够轻松并选择性地保留蛋白糖基之类的极性化合物。此外，该吸附剂具有弱碱性表面，能够基于离子交换和静电场排斥提供进一步的选择性优势。同样值得一提的是GlycoWorks μElution提取板专门针对最小洗脱体积而设计，因而样品无需进行干燥步骤即可马上分析。此外，GlycoWorks μElution提取板为96孔样式，这意味着它可用于高通量实验，或者在低通量实验中连续使用。
HILIC SPE去除色谱干扰
和RapiFluor-MS N-糖试剂盒的其它方面一样，我们对该GlycoWorks SPE步骤进行了深入评估。我们配制了一种测试混合物以评价RapiFluor-MS标记的多种N-糖的回收率，混合物中包括从小分子量中性蛋白糖基到高分子量的四唾液酸化蛋白糖基在内的多种蛋白糖基。这样的混合物通过从混合人源IgG和牛胎球蛋白释放N-糖并对其进行标记制备而成。
可以看出，经过两次SPE处理的样品呈现出的标记蛋白糖基谱图与只经一次SPE处理的样品的谱图相当。实验表明GlycoWorks SPE是一种可立即分析所
提取的标记蛋白糖基样品的有效机制，而且对于多种N-糖来说，该方法都不会对其相对丰度的准确性造成显著影响。
使用GlycoWorks HILIC Elution提取板对RapiFluor-MS标记的N-糖进行SPE提取
结论
使用传统方法制备用于HILC-FLR-MS分析的N-糖要么费时费力，要么对灵敏度有不利影响。我们新开发的GlycoWorks RapiFluor Fluor-MS N-糖分析试剂盒克服了这些缺点，可实现前所未有的蛋白糖基检测灵敏度，同时还能提高N-糖样品的制备通量。
该方法可在大约10 min内完成糖蛋白的糖基释放并生成N-糖胺。然后，这些蛋白糖基与新型RapiFluor-MS试剂快速反应，在5 min的反应时间内即可被标记上由高效荧光基团以及能提高荧光及MS检测灵敏度的强碱性叔胺基团组成的标记物。在用时不超过15 min的最终步骤中，通过μElution HILIC SPE方法将所得的RapiFluor-MS标记蛋白糖基从反应副产物中提取出来，这一精心开发的SPE提取方法能够对多种蛋白糖基进行定量回收，并且样品一经提取就能立即分析。因此，高灵敏度的RapiFluor-MS标记试剂让分析人员在30 min内即可完成从糖蛋白到待分析样品的N-糖样品制备过程。
如需进一步了解，
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