糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,在糖苷酶的催化下,将对应糖链转移到蛋白质上形成的。根据糖基化发生的化学键类型,可将蛋白糖基化修饰主要分为N-糖基化和O-糖基化。
N糖链和蛋白质的天冬酰胺的自由基-NH2共价连接,这种糖基化称为N-糖。N-糖的类型和含量会直接或间接影响蛋白的生物学活性,免疫原性以及半衰期等。
针对N-糖定量分析,沃特世使用Glycoworks RFMS N-糖试剂盒结合荧光检测器建立了单抗中G0F含量测定标准,结果如下图所示:
标曲信息
1.
相同体积,不同浓度的蛋白建立线性。
标曲5点:0.8 mg/mL、1.4 mg/mL、2.0 mg/mL、2.6 mg/mL、3.2 mg/mL(相当于标准浓度的40%、70%、100%、130%、160%)
2.
每个浓度制备3个平行样,以标准中的进样体积为100%,各进样1针,建立体积 — 峰面积标准曲线,取平行样的平均值。
所需的样品制备试剂盒和样品前处理注意事项
Glycoworks RFMS N-糖试剂盒为游离N糖分析设计了快速精简的工作流程,不仅使N-糖检测具有了前所未有的荧光和质谱性能,还大大提高了样品制备的通量,是生物制药实验室一直期待的精简化操作流程。
操作注意事项:
1.
适当延长变性、酶解、标记的时间,建议延长时间是标准方案中的2倍;
2.
样品进行纯化时,控制真空泵压力,控制样品流速,匀速流出;
3.
由于每个样品试剂取样量较少,需操作一致,避免取量差异大造成重现差。