1. 介绍
目前,因微孔板和深孔板具有可以同时培养多种培养物,节省筛选的时间和成本的优点。将其用于细胞培养、细菌、酵母菌和真菌培养的意义越来越大。
与静态培养相比,使用摇床会产生更好的培养效果。摇床可以提供高质量的温度分布,而湿度只能达到 85%。这可能导致微孔板中培养液的蒸发损失和污染。这些问题是否会发生,取决于实验条件:如果使用 2 mL 的深孔板,覆盖有透气膜并孵育过夜,通常并没有很大的损失。而 96 孔板中的液体少,可能需要额外的保护才能得到令人满意的实验结果。
2. 实验条件
实验均使用带有直接蒸汽加湿功能的 Multitron (INFORS HT)进行。实验条件如下:温度:37°C、转速:250 rpm、湿度:85%,并且在保湿盒的顶盖上装有特氟龙滤膜。
为证明保湿盒的顶盖中滤膜的气体传输能力,使用了 CO2 气体。将酶标板保湿盒放在 Multitron 内,CO2 浓度设置为 5%,微孔板的盒子用氮气充气以防止 CO2进入。然后,停止供应氮气并测量培养室和箱中的 CO2浓度。
培养物:大肠杆菌,大肠杆菌细胞浓度以湿重表示。
使用的微孔板是:Costar 3799,96 孔,圆底带盖,无热原,聚苯乙烯。每孔分别加入 150 µL 水和培养基。透气膜:BrandTech 密封透气膜。
图 1:酶标板保湿盒
3. 气体传输能力
下图表明,保湿盒子内 CO2 浓度在大约 10 min 内达到 4%,在大约 30 min 内达到 5%,这表明细胞和微生物培养的气体可以充足地传输到保湿盒。而滤膜类型之间或有/无振动之间没有显著差异。
然而,从保湿盒顶盖上取下滤膜会加快气体传输:大约 4 min 内 CO2 浓度达到 5%。
图 2:CO2 在不同类型保湿盒中的浓度累积图
关闭摇床箱门后,记录摇床内和保湿盒内的湿度(图 3)。比较表明,箱内的湿度跟随箱内的湿度存在约 5% 的偏差。在 15 min 内在摇床腔体内和保湿盒内达到饱和度。
图 3:摇床腔体内和保湿盒内湿度的增加图(盖子上带有特氟龙滤膜)
4. 蒸发
a) 主动加湿
蒸发数据分析表明,主动增加 85% 的湿度,蒸发量小,24 h 内平均约为 0.6%(图 4),因此该值可忽略不计。而在 65% 的相对湿度下,蒸发率在 24 h 内上升到 3.6%。
图 4:在 85% 和 65% 相对湿度下96 孔板中每 24 小时的平均蒸发百分比(每孔 150 µL)
对于易污染的培养物,例如细胞培养,建议使用顶盖中的气体滤膜,并在需要时提供严格无菌的孵育环境。如果盒子定期高压灭菌,建议在每次高压灭菌之前放置一个新的纸滤膜。
然而,对于大多数培养,气体滤膜的使用并不是必要的。带有孔的顶盖会提供足够的保护,减少蒸发并防止污染。移除气体滤膜后,气体传输速度比使用气体滤膜快 10 倍。因此,建议使用不带气体滤膜的保湿盒进行微生物的高密度培养。
b) 不主动加湿
在酶标板保湿盒内孵育 96孔板,但不主动加湿,将在 24 h 内造成 6% 到 12% 的蒸发损失,具体取决于微孔板的品牌:
微孔板品牌
TPP
No name
24h 蒸发损失
5.9%
11.4%
(Data from Infors AG, Dr. D. Bruecher)。
作为被动加湿的一种方式,可以将一层(= 6 片)装满水的开放式 6 孔板置于保湿盒中。这导致蒸发损失减少 50%。
微孔板品牌
TPP
No name
被动加湿 24 h 蒸发损失
2.6%
5.0%
(Data from Infors AG, Dr. D. Bruecher)。
5. 96孔板中微生物的生长
96 孔板中大肠杆菌在微孔板盒内培养的比较表明,无论微孔板是未覆盖、用塑料盖盖住还是用透气膜盖住,生长都没有差异(图 5)。
图 5:6 h 内大肠杆菌的生长曲线
图 6:带有透气膜的大肠杆菌 48 h 的生长曲线